路 貴，段虎斌

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是神經(jīng)外科的急危重癥，也是導致青壯年死亡和致殘的主要病因之一［1］。大量的研究表明，繼發(fā)性腦損傷是致死和致殘的重要原因，腦創(chuàng)傷后引起的繼發(fā)性腦水腫、神經(jīng)炎癥反應及神經(jīng)細胞凋亡等都可以再次加重腦損傷［2］。近年來隨著研究的深入，粒細胞集落刺激因子（granulocyte－colony stimulating factor，G－CSF）作為一種神經(jīng)保護因子成為了研究的熱點。G－CSF 是一種造血生長因子，臨床上主要用于治療各種原因引起的中性粒細胞減少癥以及動員外周血干細胞移植治療免疫性疾病。研究顯示，在腦缺血時G－CSF能夠減少腦梗死面積，促進神經(jīng)功能恢復［3］。但G－CSF在創(chuàng)傷性腦損傷方面的研究還很少見，具體機制尚不清楚。因此，本實驗嘗試用G－CSF 治療創(chuàng)傷性腦損傷，探討GCSF在創(chuàng)傷性腦損傷促進神經(jīng)再生方面的作用，為臨床應用GCSF治療創(chuàng)傷性腦損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制備

1.1.1 實驗動物及分組 健康成年雄性Wistar大鼠60只，清潔級，體重220g～250g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。隨機分成3 組：假手術(shù)對照組（Sham 組）、腦創(chuàng)傷對照組（TBI組）、G－CSF治療組（G－CSF組），每組20例；然后按照術(shù)后1d、4 d、7d、14d隨機分為4個亞組，每個亞組5只。Sham 組僅暴露右頂骨，并于右頂骨鉆一直徑5mm 骨孔即可；G－CSF組制備模型后立即腹腔注射G－CSF（齊魯制藥廠）50μg／（kg·d），共3d；TBI組制備模型后立即腹腔注射等量0.9%NaCl，共3d。另外，各組大鼠于實驗開始給予每日腹腔注射BrdU（北京博奧森）50 mg／（kg·d），連續(xù)5d。

1.1.2 模型制備 按Feeney法［4］自由落體致傷原理制備大鼠中度TBI模型，用10%水合氯醛（300mg／kg）腹腔注射麻醉，取俯臥位，將大鼠固定在腦立體定位儀（日本成貿(mào)公司）上，頂部備皮，碘伏消毒，沿正中線切開頭皮、剝離骨膜，暴露右頂骨。用牙科臺式電鉆（寧波醫(yī)療器械廠）于冠狀縫后1.5 mm，中線右旁2.5mm 處鉆一直徑約5mm 的圓形骨窗，保持硬腦膜完整，將撞擊裝置（軍事醫(yī)學科學院儀器廠加工）的撞桿頭端置骨窗外，以0.048N·s（20g重錘，30cm 高度）沖擊力撞擊大鼠右側(cè)腦部中央前回皮層，然后用骨蠟封閉骨孔，切口縫合。撞桿打擊后大鼠立即出現(xiàn)腦組織膨隆，硬腦膜未破裂，認為打擊有效。術(shù)后每只大鼠肌肉注射硫酸慶大霉素4×104U，以防感染。假手術(shù)組大鼠接受同樣的手術(shù)操作，但是不用撞桿撞擊。

1.2 神經(jīng)功能評價 各組大鼠于術(shù)前1d及術(shù)后1d、4d、7d、14d時，嚴格按照經(jīng)典的神經(jīng)功能缺失評分（mNSS）標準［5，6］，分別通過感覺、運動、平衡木測試及反射活動等進行評分，各項總分相加為行為評定總分，最高18分，最低3分，分數(shù)越低，說明神經(jīng)功能恢復越好。

1.3 腦組織免疫熒光染色

1.3.1 石蠟標本制備 各組大鼠均于術(shù)后1d、4d、7d、14d時處死，取腦組織制備石蠟標本。過程如下：大鼠麻醉后暴露心臟，左心室插管，剪開右心耳放血，用生理鹽水快速心臟灌注，見右心耳流出清亮液體后，改用4%多聚甲醛灌注固定，固定好后取腦組織置于4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定24h，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，行BrdU 及BrdU／NeuN 免疫熒光染色。

1.3.2 BrdU 單標染色 腦組織石蠟切片常規(guī)脫蠟，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，高壓枸櫞酸鹽熱修復2 min 40s，5%正常山羊血清（武漢博士德）室溫孵育30min傾去勿洗，滴加1∶100的小鼠抗BrdU一抗（北京博奧森）4℃冰箱過夜，PBS洗5 min×3次，滴加1∶50的山羊抗小鼠IgG 熒光FITC二抗（北京博奧森），避光37 ℃溫箱孵育60min，PBS洗8min×3次，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡（OLYMPUS公司）下觀察并采集圖片。每張切片在腦損傷周圍隨機取5個視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)。

1.3.3 BrdU／NeuN 雙標染色 同上5%正常山羊血清封閉后，滴加1∶100 的小鼠抗BrdU 和1∶150兔抗大鼠NeuN（北京博奧森）混合一抗，4℃冰箱過夜，PBS洗5min×3次，滴加1∶50的山羊抗小鼠IgG 熒光FITC 和1∶50山羊抗兔IgG 熒光CY3（北京博奧森）混合二抗，避光37 ℃溫箱孵育60 min，PBS洗8min×3次，緩沖甘油封片，同上熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)雙陽性細胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理 運用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用析因設計的方差分析，組間比較用LSD－t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能評分 腦創(chuàng)傷后大鼠都有不同程度的神經(jīng)功能缺失，術(shù)后2d最重，后隨時間延長逐漸恢復。G－CSF組在第1 d時mNSS評分和TBI組比較差異無統(tǒng)計學意義，于第4d、7 d、14d時mNSS評分明顯低于TBI組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Sham 組各時間點mNSS評分基本沒有變化。詳見表1。

表1 各組大鼠mNSS評分評分比較 分

表1 各組大鼠mNSS評分評分比較 分

與Sham 組比較，1）P＜0.05；與TBI組比較，2）P＜0.05

組別 n1d 4d 7d 14d Sham 組20 1.54±0.23 0 0 0 TBI組 20 10.45±0.63 9.92±0.551） 8.21±0.481） 7.31±0.461）G－CSF組 20 10.48±0.65 7.33±0.471）2） 4.87±0.531）2） 3.40±0.431）2）

2.2 腦組織免疫熒光染色結(jié)果 Sham 組幾乎沒有BrdU 陽性細胞，G－CSF組可見創(chuàng)傷灶周邊有BrdU 陽性細胞，并于第1天開始散在出現(xiàn)，7d時達到高峰，14d時有所下降；G－CSF 組4 d、7d、14d創(chuàng)傷腦組織周圍BrdU 陽性細胞數(shù)明顯高于Sham組、TBI組（P＜0.05），且TBI組BrdU 陽性細胞數(shù)也明顯高于Sham 組（P＜0.05）；對比各組7d時創(chuàng)傷腦組織周圍BrdU／Ne uN雙陽性細胞數(shù)，G－CSF組明顯高于Sham組、TBI組（P＜0.05），且TBI組也明顯高于Sham組（P＜0.05）。詳見圖1、圖2。

圖1 各組創(chuàng)傷腦組織周圍BrdU 陽性細胞數(shù)比較

圖2 各組創(chuàng)傷腦組織周圍BrdU／NeuN 雙陽性細胞數(shù)比較

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，G－CSF 及其受體（G－CSFR）在正常腦組織中有少量表達，當腦組織受到損傷時，可見損傷灶及周圍腦組織G－CSF／G－CSFR 表達明顯增加，給予外源性的G－CSF 可以通過血腦屏障，并結(jié)合于神經(jīng)細胞膜上的G－CSFR，通過一系列信號轉(zhuǎn)導發(fā)揮神經(jīng)保護作用［7，8］。另有研究證實鼠G－CSF與人類G－CSF的蛋白序列同源性高達73%，可以將重組人G－CSF用于大鼠或小鼠實驗［9］。這些證據(jù)為本實驗應用GCSF提供了實驗依據(jù)。

目前研究發(fā)現(xiàn)在大鼠海馬齒狀回的顆粒下區(qū)和室管膜下區(qū)存在多向分化潛能的神經(jīng)干細胞［10］。腦損傷時，這些區(qū)域干細胞可以在各種細胞因子的作用下遷徙到腦組織損傷區(qū)，分化為神經(jīng)細胞，從而促進神經(jīng)功能恢復，但這種自身修復能力極為有限。BrdU 是胸腺嘧啶類似物，可以替代胸腺嘧啶在細胞DNA合成期（S期）滲入到細胞核內(nèi)，并穩(wěn)定存在于細胞核DNA 上，對細胞增殖沒有影響［11］；NeuN 即神經(jīng)元核蛋白，是神經(jīng)元特異性標志蛋白。因此，本實驗利用BrdU 陽性細胞作為新生增殖細胞的標志，BrdU／NeuN 雙陽性細胞表示新生神經(jīng)細胞分化為神經(jīng)元，應用免疫熒光技術(shù)對創(chuàng)傷周圍腦組織陽性細胞進行計數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)Sham 組幾乎找不到BrdU 陽性細胞，TBI組偶見創(chuàng)傷周邊有BrdU 陽性細胞，表明正常情況下腦組織幾乎沒有神經(jīng)細胞再生，而在腦損傷時，由于損傷刺激可誘導細胞增殖，但新生細胞數(shù)量很有限。本實驗結(jié)果也表明，G－CSF組創(chuàng)傷腦組織周圍BrdU 陽性細胞在用藥以后明顯增多，7d時達到高峰，并明顯高于TBI組和Sham 組；在促進新生細胞向神經(jīng)元分化方面，G－CSF組也具有明顯的優(yōu)勢。Khatibi等［12］研究結(jié)果也表明G－CSF 治療可明顯減少腦創(chuàng)傷后細胞死亡和腦水腫。另外G－CSF組大鼠mNSS評分明顯減低，并與TBI組相比差異有統(tǒng)計學意義，這可能與G－CSF減輕腦組織損傷和增加神經(jīng)細胞再生密切相關(guān)。Yang等［13］研究也發(fā)現(xiàn)在腦創(chuàng)傷后給予GCSF能明顯提高細胞增殖和運動功能恢復。還有研究發(fā)現(xiàn)GCSF能動員骨髓間充質(zhì)干細胞進入外周血，并促進其向腦損傷區(qū)遷徙分化成神經(jīng)細胞，對損傷腦組織進行修復［14］。本實驗也發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷灶及周圍腦組織有新生神經(jīng)細胞，但這些新生的細胞是來源于骨髓干細胞還是內(nèi)源性干細胞還有待進一步研究證實。

綜上所述，創(chuàng)傷性腦損傷后給予G－CSF輔助治療，能顯著提高創(chuàng)傷后神經(jīng)功能恢復，促進創(chuàng)傷腦組織周圍細胞增殖，并向神經(jīng)元分化。為臨床應用G－CSF 治療創(chuàng)傷性腦損傷提供了理論依據(jù)，具體機制還需進一步研究。

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