崔 梅，陳方哲，陳淑芬，陸征宇，董 強(qiáng)

組織激肽釋放酶（tissu kallikrein，TK）是激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)（kallikrein－kinin system，KKS）的重要組成部分，主要通過(guò)其底物的酶解產(chǎn)物激肽，間接激活緩激肽B1 受體（B1R）和B2 受體（B2R）而參與體內(nèi)許多生理和病理過(guò)程［1］。近年大量研究已經(jīng)證實(shí)TK 或TK 基因?qū)θ毖俟嘧p傷具有明確的保護(hù)作用，但對(duì)其機(jī)制卻不甚了解。

神經(jīng)元線粒體運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)蛋白（Mitochondrial movement protein）的主要功能是調(diào)節(jié)線粒體在神經(jīng)元中的移動(dòng)，保證線粒體的正確分布以應(yīng)對(duì)病理?yè)p傷［2］。在腦缺血過(guò)程中，線粒體的正常分布和運(yùn)動(dòng)對(duì)神經(jīng)元功能的實(shí)現(xiàn)具有重要意義。激肽釋放酶能否影響線粒體運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)蛋白未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在觀察激肽釋放酶對(duì)糖氧剝奪神經(jīng)元線粒體運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 新生SD 大鼠由上海斯萊克公司提供；D－Hanks液、DMEM 高糖培養(yǎng)液、Neurobasal A 培養(yǎng)液、B27supp lement、谷氨酰胺、胎牛血清、青霉素和鏈霉素等購(gòu)自Gibco 公司；神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE），Miro1、Miro2、Milton 抗體購(gòu)自Calbiochem 公司；抗大鼠微管相關(guān)蛋白（MAP2）多克隆抗體購(gòu)自Abcam 公司；活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit－8，CCK－8）購(gòu)于日本同仁公司；蛋白濃度測(cè)定試劑盒（BCA法）購(gòu)于上海申能博彩生物試劑公司；組織激肽釋放酶由廣州天普公司提供。

1.2 皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng) 按文獻(xiàn)報(bào)道［3］進(jìn)行原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)，主要步驟如下：斷頭取出生24h內(nèi)SD 大鼠的腦組織，在預(yù)冷的D－Hanks液中用血管鑷仔細(xì)去除腦膜和血管，分離出大腦皮層并經(jīng)0.125%EDTA2胰蛋白酶37 ℃酶解10min，用吸口圓潤(rùn)的玻璃吸管吹打至細(xì)胞分散，細(xì)胞懸液于4℃1 000r／min 離心5min，棄上清，沉淀用神經(jīng)元種植液（含90%DMEM高糖培養(yǎng)基和10%胎牛血清）重懸。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將細(xì)胞以2.5×105／mL～1.0×106／mL的密度種植于L－多聚賴氨酸（0.1mg／mL）包被的相應(yīng)培養(yǎng)容器中，置持續(xù)通入混合氣體（含95%O2和5%CO2）的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜。次日將培養(yǎng)液全部更換為神經(jīng)元基本培養(yǎng)液（NeurobasalA 培養(yǎng)液含2%B27 supplement、0.5mmol／L谷氨酰胺、1%青霉素和1%鏈霉素），培養(yǎng)48h后在培養(yǎng)液中加入5－氟2′－脫氧尿苷（終濃度20μg／mL）以抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，之后每隔3d～4d更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)7d～10d。

1.3 神經(jīng)元純度鑒定 從培養(yǎng)7d～10d的神經(jīng)元中任取一份，經(jīng)MAP2免疫染色和Hoechst33342染色鑒定，用4%多聚甲醛室溫固定30min，30%H2O2室溫封閉，滴加1∶100 稀釋的MAP2一抗，37 ℃1h，滴加熒光二抗，37 ℃1h 后，Ho echst 3 3 3 4 2染色。甘油封片。陰性對(duì)照用PBS液代替一抗，Olympus熒光顯微鏡400倍視野下，隨機(jī)選取6個(gè)區(qū)域，計(jì)數(shù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)蛋白MAP2 陽(yáng)性細(xì)胞和視野中所有hoechst陽(yáng)性細(xì)胞，用總MAP2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占hoechst陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的百分率表示神經(jīng)元純度。

1.4 神經(jīng)元氧糖剝奪模型（OGD）的建立 神經(jīng)元OGD 再恢復(fù)損傷模型：取培養(yǎng)7d～10d的皮層神經(jīng)元（吸出培養(yǎng)液置無(wú)菌管中待用）用正常細(xì)胞液洗滌神經(jīng)元3次，加入預(yù)先用無(wú)氧混合氣體（含5%CO2、10%H2和85%N2）飽和的無(wú)糖細(xì)胞液后置厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)，持續(xù)通入無(wú)氧混合氣體（含5%CO2、10%H2和85%N2）使箱內(nèi)氧濃度低于1%，90min后從厭氧培養(yǎng)箱取出細(xì)胞，用正常細(xì)胞液洗滌3次，加入吸出待用的培養(yǎng)液，置常氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及處置 皮層神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天，隨機(jī)分為正常培養(yǎng)組（C 組）、正常培養(yǎng)＋TK 干預(yù)組（C＋TK 組）、氧糖剝奪組（OGD 組）、氧糖剝奪＋TK 干預(yù)組（OGD＋TK 組）。C 組按正常培養(yǎng)方法培養(yǎng)；C＋TK 組在正常培養(yǎng)的神經(jīng)元培養(yǎng)液中加入血TK 使其終濃度為100nmol／L 后按正常培養(yǎng)24h；OGD組神經(jīng)元進(jìn)行缺糖、缺氧后復(fù)糖、復(fù)氧處理；OGD＋TK 組神經(jīng)元用100nmol／L TK 處理24h 后進(jìn)行缺糖、缺氧后復(fù)糖、復(fù)氧處理。

1.6 神經(jīng)元活力檢測(cè) 按活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒說(shuō)明書操作檢測(cè)神經(jīng)元存活率。將培養(yǎng)至7d的96孔板內(nèi)皮層神經(jīng)元按上述1.5方法進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)結(jié)束時(shí)，棄去上述各組神經(jīng)元培養(yǎng)液，用正常細(xì)胞液洗滌3 次，每孔加入神經(jīng)元活力檢測(cè)液100μL（含10%CCK－8液和90%NeurobasalA 液），37 ℃培養(yǎng)箱孵育

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)元純度 培養(yǎng)7d 的神經(jīng)元用神經(jīng)元特異性的MAP2進(jìn)行檢驗(yàn)后，結(jié)果表明按上述方法培養(yǎng)的神經(jīng)元純度至少為90%。

2.2 TK 對(duì)OGD 后神經(jīng)元存活率影響 C＋TK 組神經(jīng)元存活率與C 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與C 組比較OGD 組神經(jīng)元存活率顯著下降（P＜0.01）；與OGD 組比較，OGD＋TK 組神經(jīng)元存活率升高（P＜0.01）。詳見(jiàn)表1。1h～3h。以僅有檢測(cè)液的孔為空白對(duì)照，在450nm 為測(cè)定波長(zhǎng)，630nm 為參比波長(zhǎng)條件下，測(cè)定各樣品的吸光度（OD 值）。每組取4個(gè)復(fù)孔，分別進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。按公式：神經(jīng)元存活率（%）＝實(shí)驗(yàn)組OD 值／對(duì)照組OD 值×100%計(jì)算神經(jīng)元存活率。

1.7 Caspase－3活性檢測(cè) 將接種于直徑10cm 培養(yǎng)皿內(nèi)的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)至第7 天，各組神經(jīng)元處理方法同上述1.5。干預(yù)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，加入RIPA 蛋白質(zhì)提取液，4 ℃靜置1 h（期間吹打數(shù)次使細(xì)胞充分裂解）后，4 ℃18 000g 離心20 min，取上清液，按BCA 法蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書測(cè)定上清液的蛋白濃度。Caspase－3活性測(cè)定：按Caspase－3 活性檢測(cè)試劑盒（R＆D 公司）說(shuō)明書操作。簡(jiǎn)言之，按100μg蛋白的量提取的蛋白上清液，與等體積反應(yīng)緩沖液混合后用試劑盒內(nèi)的蛋白稀釋液將各組混合液體積調(diào)節(jié)至200μL，分別加入96孔板內(nèi)，每孔再加5μL Caspase－3熒光底物，混勻后置37 ℃孵育2 h。以雙蒸水替代蛋白上清液、反應(yīng)緩沖液及底物組成的等體積混合液為對(duì)照1（C1），以不含反應(yīng)底物的混合液為對(duì)照2（C2），以505nm 為測(cè)定波長(zhǎng)，650nm 為參比波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的吸光度（OD 值）。每次實(shí)驗(yàn)取3 個(gè)復(fù)孔，分別進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。按公式：Caspase－3相對(duì)活性＝實(shí)驗(yàn)組OD 值－（C1＋C2）OD 值／對(duì)照組OD 值－（C1＋C2）OD 值計(jì)算各組Caspase－3的相對(duì)活性。

1.8 Miro1、Miro2、Milton蛋白表達(dá)的檢測(cè) 用Western blot法，內(nèi)參照為GAPDH。RIPA 提取細(xì)胞總蛋白，按BCA 法蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書測(cè)定蛋白濃度。行SDS－PAGE 不連續(xù)凝膠電泳，蛋白上樣量50μg。濕式轉(zhuǎn)模（150 mA，1.5h）后，5%脫脂牛奶封閉2h。分別加兔抗大鼠Miro1、Miro2、Milton單克隆抗體，分別按1∶200，1∶200，1∶250稀釋，室溫孵育2 h，將膜與二抗稀釋液中的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶3 000）室溫封閉1h，酶法顯色。圖像分析系統(tǒng)測(cè)各條帶平均吸光度（A）值和條帶的面積，每一條帶的蛋白含量用此條帶的吸光度值乘以條帶的面積與同一樣本的GAPDH 條帶的吸光度值乘以條帶的面積的比值表示。

表1 TK 對(duì)OGD損傷神經(jīng)元存活率的影響

表1 TK 對(duì)OGD損傷神經(jīng)元存活率的影響

與C組比較，1）P＜0.01；與OGD組比較，2）P＜0.01

組別 神經(jīng)元存活率（%）C組100 C OG＋DTK組 組 6973..21±±02..6 11）OGD＋TK 組 82.4±0.61）2）

2.3 TK 對(duì)OGD 后神經(jīng)元Caspase－3活性的影響 與C 組比較，單純OGD 可顯著誘導(dǎo)Caspase－3的活化（P＜0.01）；TK 能拮抗OGD 所誘導(dǎo)的Caspase－3活性增加。詳見(jiàn)表2。

表2 TK 對(duì)OGD損傷神經(jīng)元Caspase－3相對(duì)活性的影響

表2 TK 對(duì)OGD損傷神經(jīng)元Caspase－3相對(duì)活性的影響

與C組比較，1）P＜0.01；與OGD組比較，2）P＜0.01

組別 Caspase－3相對(duì)活性C組1.02±0.05 C＋TK 組 1.01±0.04 OGD組 1.84±0.031）OGD＋TK 組 1.41±0.091）2）

2.4 TK 對(duì)OGD 后神經(jīng)元Miro1，Miro2和Milton蛋白的影響

C＋TK 組神經(jīng)元Miro1，Miro2 和Milton表達(dá)量較C組高（P＜0.01）；OGD 組與C組相比，Miro1、Miro2、Milton表達(dá)量均明顯下降（P＜0.01）；而TK 干預(yù)可顯著逆轉(zhuǎn)OGD 所導(dǎo)致的神經(jīng)元線粒體運(yùn)動(dòng)蛋白Miro1，MMiro2，Milton的表達(dá)變化（P＜0.01）。詳見(jiàn)表3。

表3 TK 對(duì)OGD后神經(jīng)元Miro1，Miro2和Milton蛋白的影響

表3 TK 對(duì)OGD后神經(jīng)元Miro1，Miro2和Milton蛋白的影響

與C組比較，1）P＜0.01；與OGD組比較，2）P＜0.01

組別 Miro1 Miro2Milton C組0.42±0.03 0.61±0.04 0.64±0.08 C＋TK 組 0.53±0.091） 0.70±0.021） 0.77±0.051）OGD組 0.21±0.021） 0.31±0.051） 0.29±0.071）OGD＋TK組 0.33±0.041）2） 0.52±0.061）2） 0.49±0.031）2）

3 討 論

腦組織是能量要求極高的器官，在缺血后由于氧氣及葡萄糖供應(yīng)缺乏，神經(jīng)元出現(xiàn)了嚴(yán)重的細(xì)胞能量代謝障礙。而與之伴隨的是細(xì)胞興奮性氨基酸釋放增多，鈣離子調(diào)節(jié)障礙及細(xì)胞凋亡，線粒體是神經(jīng)細(xì)胞中非常重要的細(xì)胞器，它們給神經(jīng)細(xì)胞提供能量，支持神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)，線粒體能夠產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）維持神經(jīng)細(xì)胞的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。

由于神經(jīng)細(xì)胞具有非常特殊的形狀，具有很多長(zhǎng)而突出的樹突和軸突，線粒體由于其大小和功能的局限性，往往需要從細(xì)胞內(nèi)較遠(yuǎn)的地方遷移到另一個(gè)位置來(lái)完成某些功能，因此需要完善的調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)保證。近年來(lái)，眾多學(xué)者提出了線粒體動(dòng)力調(diào)節(jié)蛋白的概念［4－6］。即在神經(jīng)元軸突末梢釋放遞質(zhì)時(shí)，需要大量能量供應(yīng)，此時(shí)細(xì)胞將線粒體迅速轉(zhuǎn)運(yùn)到能量要求高的部位。線粒體動(dòng)力調(diào)節(jié)蛋白的主要功能是保證細(xì)胞內(nèi)線粒體的正確分布，以應(yīng)對(duì)病理?yè)p傷。如果細(xì)胞缺失這種蛋白，那么神經(jīng)元中大量的線粒體就離開(kāi)它們正常的位置而回到胞體周圍，只留下一些空洞和沒(méi)有線粒體支持的樹突和軸突［7］。目前研究認(rèn)為Miro蛋白（Miro1 和Miro2）和Milton 蛋白是主要的線粒體動(dòng)力調(diào)節(jié)蛋白。

有關(guān)TK 在缺血性腦損傷中的作用，Xia等［8］應(yīng)用TK 轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行研究，提示TK 在腦梗死中有明確的神經(jīng)保護(hù)作用，可減少腦梗死體積、減少梗死后的細(xì)胞凋亡、減弱腦內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)、增加膠質(zhì)細(xì)胞的存活和遷移。同樣在體外細(xì)胞培養(yǎng)［9］中也發(fā)現(xiàn)TK 干預(yù)能夠劑量依賴地抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。邵淵等［10，11］發(fā)現(xiàn)，TK 和帶有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域的激肽釋放酶（PTD－kallikrein）均可通過(guò)緩激肽受體的介導(dǎo)而明顯減輕OGD 后再恢復(fù)正常所誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷以及MCAO 大鼠的再灌注損傷。這些研究結(jié)果提示缺血后TK 發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用。而關(guān)于TK在腦缺血后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制目前還不明確。

本研究結(jié)果顯示，TK 在OGD 誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元損傷中具有明確的保護(hù)作用，TK 能夠顯著增加OGD 后皮層神經(jīng)元的存活率。并能抑制Caspase－3激活，減少神經(jīng)元凋亡。表明TK 對(duì)OGD 后皮層神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)作用。

而對(duì)于TK 對(duì)OGD 后神經(jīng)元內(nèi)線粒體動(dòng)力調(diào)節(jié)蛋白的影響，目前尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD 可顯著降低線粒體動(dòng)力蛋白Miro1、Miro2 和Milton 蛋白的表達(dá)，提示在OGD 損傷后神經(jīng)元內(nèi)存在線粒體動(dòng)力調(diào)節(jié)障礙。這可能與OGD 后細(xì)胞能量代謝障礙過(guò)程密切相關(guān)。而TK 干預(yù)可以顯著逆轉(zhuǎn)OGD 所導(dǎo)致的Miro1、Miro2 和Milton 蛋白表達(dá)變化。提示TK 對(duì)OGD 后神經(jīng)元的保護(hù)作用可能與誘導(dǎo)線粒體運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，皮層神經(jīng)元在TK 干預(yù)后，可以顯著上調(diào)神經(jīng)元線粒體運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)蛋白Miro1、Miro2 和Milton的表達(dá)，保護(hù)了神經(jīng)元。但其機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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