范 雯，曾建偉，黃露芬，高麗萍，蔡 晶

血管性認(rèn)知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）是各種可能影響腦功能的心腦血管疾病導(dǎo)致認(rèn)知功能下降的綜合征，其含義包括了血管性癡呆（VaD），有乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)的降低［1，2］。目前認(rèn)為，VCI與興奮性氨基酸（EAA）毒性、興奮性氨基酸與抑制性氨基酸（IAA）失衡等有關(guān)［2，3］。本文從血管性認(rèn)知障礙模型大鼠大腦海馬組織內(nèi)興奮性氨基酸、抑制性氨基酸以及與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的含量及其受體表達(dá)的變化，探討補(bǔ)腎活血方對血管性認(rèn)知障礙模型大鼠神經(jīng)遞質(zhì)及其受體的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 Wistar大鼠3月齡的大鼠（福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供），體重（245±26）g，大鼠按體重隨機(jī)分組，正常飼養(yǎng)，維持室溫20 ℃～22 ℃，自由攝食與飲水。

1.2 藥品及試劑 補(bǔ)腎活血方購自福建省第二人民醫(yī)院中藥房，由肉蓯蓉、淫羊藿、制黃精、丹參煎煮而成，混懸液為0.371g成藥／mL，相當(dāng)于人常用劑量。陽性中成藥銀杏葉分散片由沈陽格林制藥有限公司生產(chǎn)（國藥準(zhǔn)字Z20060440，每片0.5g），用蒸餾水配制，混懸液濃度為0.01g成藥／mL，相當(dāng)于人常用劑量。乙酰膽堿（ACh）、5－羥色胺（5－HT）、多巴胺（DA）、谷氨酸（Glu）、γ－氨基丁酸（GABA）、甘氨酸（Gly）抗體均由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。兔超敏二步法免疫組化檢測試劑、濃縮型DAB 試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。Gly、ACh、GABA、Glu、5－HT、DA 標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司，美國），含3－巰基丙酸的鄰苯二甲醛試劑（批號：5061－3335，F(xiàn)luka公司），0.4N 硼酸緩沖液（批號：5061－3339，F(xiàn)luka公司），乙腈（色譜純，德國Merck公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 1200高效液相色譜儀，包括G1311A 四元泵，G1316A 柱溫箱，G1329A 自動進(jìn)樣器，G1329A 熒光檢測器和化學(xué)工作站（美國Agilent公司）。CP225D 電子天平（德國Sartorius公司），Milli－Q 超純水機(jī)（法國Millipore公司），100μL 圓頭注射器。臺式低溫高速冷凍離心機(jī)（德國Hettich公司），超聲波細(xì)胞破碎儀（美國Sonics公司）。

1.4 分組及造模方法 Wistar大鼠40只，按體重隨機(jī)分成4組：假手術(shù)組、模型組、銀杏葉組、補(bǔ)腎活血方組，每組10只，雌雄各半。各組采用雙頸總動脈永久結(jié)扎法（2－VO）造模，參照Eklof方法改良。具體步驟如下：大鼠造模前禁食（不禁水）1h。以鹽酸氯胺酮注射液0.3 mL／100g體重劑量腹腔注射麻醉。將大鼠仰臥并固定在手術(shù)臺上，頸部皮膚常規(guī)消毒。頸正中切口，仔細(xì)分離肌肉，分出雙側(cè)頸總動脈。埋線，用絲線結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈。分層縫合肌肉及皮膚，硫酸慶大霉素注射液涂于皮膚切口以防感染。假手術(shù)組施行相同手術(shù)，但不結(jié)扎絲線。整個(gè)手術(shù)過程保持安靜，室溫控制在25.0 ℃±0.5 ℃。

1.5 給藥方法 按動物體表面積比率換算大鼠灌胃量，補(bǔ)腎活血方、銀杏葉組分別灌胃補(bǔ)腎活血方煎劑、銀杏葉片水溶劑10 mL／kg。假手術(shù)組和模型組每天分別給予等體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃15d，2次／日。

1.6 組織標(biāo)本采集 末次給藥后大鼠禁食不禁水12h，以10%水合氯醛（300mg／kg）腹腔麻醉。各組取4只大鼠，反正反射消失后，暴露心臟，用灌注針灌注生理鹽水（4 ℃），至右心房流出的液體變清亮?xí)r，灌注多聚甲醛溶液（pH7.4）250mL 進(jìn)行固定，以肝臟變白為灌注成功，快速斷頭取腦，迅速于冰盤上取大腦海馬為主的腦組織，置于4%多聚甲醛中繼續(xù)固定30h（4℃）。另4只大鼠迅速斷頭取腦，于冰盤上取大腦海馬為主的腦組織，冰生理鹽水沖洗除去血液，濾紙吸干，稱質(zhì)量。在冰浴下按1∶9（即1g組織加生理鹽水9mL）加入冰冷的生理鹽水，用超聲細(xì)胞破碎儀破碎成10%的勻漿，3 000g 4 ℃低溫離心10 min。取上清分裝置－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 高效液相色譜法測定海馬組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量 色譜條件：色譜柱：200mm×2.1mm AA 柱和保護(hù)柱。流動相：A＝20 mmol NaAc＋0.018%TEA，用1%～2%醋酸調(diào)pH 至7.2，B＝20%的20mmol NaAc，用1%～2%醋酸調(diào)pH 至7.2＋40%乙腈＋40%甲醇。流速：0.45 mL／min。梯度：100%A，17min時(shí)60%B，18min時(shí)100%B，18.1min時(shí)流速0.45mL／min，18.5 min時(shí)流速0.8mL／min，23.9min時(shí)流速0.8mL／min，24min時(shí)100%B，流速0.45 mL／min，25 min 0%B。柱溫：40 ℃。熒光檢測：λex＝340nm，λem ＝450nm。

1.8 免疫組化染色 取出標(biāo)本依次進(jìn)行脫水、二甲苯透明、浸蠟及包埋處理，行5μm 厚的連續(xù)切片，粘于載玻片上。石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，微波抗原修復(fù)20min，自然冷卻。3%H2O2溶液室溫下孵育10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS洗3min×3次。羊正常血清室溫封閉20min，滴加一抗，4℃孵育過夜，PBS洗3min×3次。滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫靜置30min，PBS沖洗3min×3次。滴加三抗，室溫靜置30min，PBS洗3min×3次。DAB溶液顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，自來水沖洗10min，終止顯色。蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)不重復(fù)高倍鏡視野（10×40）觀察，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料使用單因素方差分析。分類資料使用Kruskal－Wallis H 檢驗(yàn)，兩兩對比使用Mann－Whitney U 檢驗(yàn)分析。兩兩比較時(shí)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α調(diào)整為α’＝0.008 3，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 補(bǔ)腎活血方對血管性認(rèn)知障礙大鼠海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織中ACh、5－HT、DA 含量減少（P＜0.05）。模型組大鼠海馬內(nèi)Glu、Gly含量較假手術(shù)組明顯增多（P＜0.01），GABA 含量較假手術(shù)組減少（P＜0.05）。與模型組相比，補(bǔ)腎活血方組大鼠海馬組織內(nèi)ACh、5－HT、DA 含量均有明顯增高（P＜0.01），同銀杏葉組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。大鼠海馬組織內(nèi)Glu、Gly含量較模型組降低（P＜0.05），GABA 含量較模型組增高明顯（P＜0.01），同銀杏葉組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 補(bǔ)腎活血方對大鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

表1 補(bǔ)腎活血方對大鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

與假手術(shù)組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01

組別 ACh（mmol／L） 5－HT（pmol／L） DA（pmol／L） Glu（μmol／mL） Gly（μmol／mL） GABA（μmol／mL）假手術(shù)組 81.17±11.97 38.71±5.30 20.57±3.31 810.79±122.50 198.23±54.47 15.83±4.56模型組 58.74±11.501） 19.49±8.231） 13.46±2.021） 1191.81±116.372） 374.59±112.232） 8.12±2.111）銀杏葉組 74.37±14.16 30.87±7.41 18.40±3.62 973.14±123.51 232.33±99.43 12.32±2.44補(bǔ)腎活血方組 73.63±10.0844） 31.64±8.974） 18.47±2.024） 964.67±164.303） 226.83±94.633） 13.85±3.784）

2.2 補(bǔ)腎活血方對血管性認(rèn)知障礙大鼠海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)受體表達(dá)的影響 模型組大鼠海馬組織內(nèi)ACh、5－HT、DA 受體表達(dá)較假手術(shù)組明顯減少（P＜0.05 或P＜0.01），Glu、Gly受體表達(dá)較假手術(shù)組明顯增多（P＜0.05或P＜0.01），GABA受體表達(dá)較假手術(shù)組明顯減少（P＜0.01）。補(bǔ)腎活血方組與模型組相比，大鼠海馬組織中ACh、5－HT、DA 受體表達(dá)均有明顯增加（P＜0.01），同銀杏葉組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。補(bǔ)腎活血方組海馬組織Glu、Gly受體表達(dá)與模型組相比減少（P＜0.05），GABA 受體表達(dá)較模型組增加（P＜0.05），與銀杏葉組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 補(bǔ)腎活血方對大鼠海馬組織各神經(jīng)遞質(zhì)受體表達(dá)的影響陽性細(xì)胞數(shù)

表2 補(bǔ)腎活血方對大鼠海馬組織各神經(jīng)遞質(zhì)受體表達(dá)的影響陽性細(xì)胞數(shù)

與假手術(shù)組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01

組別 ACh 5－HT DA Glu GlyGABA假手術(shù)組 33.4±8.9 37.1±8.8 32.4±4.2 24.0±5.6 19.6±2.8 21.0±3.8模型組 20.9±4.52） 26.3±5.42） 23.7±4.41） 35.9±3.72） 27.8±3.81） 9.7±1.92）銀杏葉組 30.5±2.8 30.6±6.0 28.6±4.9 28.1±4.8 24.4±2.6 19.0±2.4補(bǔ)腎活血方組 30.2±6.04） 28.3±3.74） 28.8±3.54） 28.9±4.33） 23.7±2.53） 20.7±3.13）

3 討 論

血管性癡呆是各類腦血管病所致的癡呆綜合征。VaD 缺乏公認(rèn)統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，很多VaD 患者在就診時(shí)已失去了最佳的預(yù)防和治療時(shí)機(jī)。為此，越來越多的研究關(guān)注了VCI。VCI是指由腦血管病危險(xiǎn)因素（如糖尿病、高血壓和高血脂等）、明顯（如腦出血和腦梗死等）或不明顯（如慢性腦缺血和白質(zhì)疏松）腦血管病引起的從早期輕度的認(rèn)知損害發(fā)展到癡呆的一類綜合征。VCI的分類包括：VaD、非癡呆血管性認(rèn)知功能障礙（vascular cognitive impairment no dementia，VCIND）以及混合性癡呆。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，65歲或以上老年人VCI的患病率約5%，并隨年齡的增大而增高［4］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中，神經(jīng)遞質(zhì)是傳遞信息的物質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)受體存在于細(xì)胞膜上或胞質(zhì)內(nèi)的大分子蛋白質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)由突觸前膜釋放，在突觸間隙擴(kuò)散，與受體特異性結(jié)合，產(chǎn)生突觸后膜去極化電位或超極化電位，引發(fā)生物效應(yīng)。目前認(rèn)為，大腦的學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙與腦內(nèi)ACh不足及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)減少密切相關(guān)。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)［5，6］，缺血時(shí)腦組織中ACh含量明顯降低，ACh 含量的降低影響腦學(xué)習(xí)認(rèn)知功能，ACh對神經(jīng)元的興奮、皮質(zhì)可塑和學(xué)習(xí)記憶過程均起到調(diào)節(jié)作用。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是CNS中調(diào)節(jié)神經(jīng)生理功能的重要物質(zhì)，包括腎上腺素、5－HT、DA 等，對腦內(nèi)所有回路系統(tǒng)均有調(diào)節(jié)作用［7］。研究表明［8，9］，在腦組織缺血缺氧過程中，大腦的神經(jīng)遞質(zhì)，尤其是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，有明顯減少，腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的減少可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降。

腦內(nèi)存在作為神經(jīng)遞質(zhì)的游離氨基酸，可分為EAA 和IAA。EAA 以Glu為代表，IAA 以GABA、Gly為代表。適量的EAA 濃度是維持包括學(xué)習(xí)、認(rèn)知、記憶、運(yùn)動和發(fā)育等正常腦功能所必需的，但當(dāng)其濃度過高時(shí)，可引起興奮性毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元腫脹和空泡變性，甚至死亡。研究表明［10，11］，腦缺血時(shí)神經(jīng)元可釋放大量Glu，同時(shí)對Glu的攝取能力下降，導(dǎo)致突觸間隙中Glu濃度持續(xù)升高，引起EAA 和IAA 比例失衡。Glu含量升高后，可引起去極化，產(chǎn)生Na＋、Cl－以及水分的細(xì)胞內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，同時(shí)Glu可激活NMDA 受體，調(diào)控開放鈣通道，導(dǎo)致細(xì)胞外Ca2＋大量內(nèi)流，引起神經(jīng)細(xì)胞的損傷或死亡。有研究表明［12，13］，腦缺血時(shí)，Gly含量的減少可以減輕腦損傷，Gly可通過激動NMDA 受體上Gly結(jié)合位點(diǎn)，影響離子通道，致Ca2＋內(nèi)流增加，擴(kuò)大腦缺血損害，故Gly雖為IAA，但仍被認(rèn)為與Glu具有協(xié)同毒性作用。GABA 是腦內(nèi)重要的IAA，主要由Glu脫羧而成，可拮抗Glu的興奮性毒性。研究發(fā)現(xiàn)［14，15］，缺血過程中，GABA 釋放增加，其幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Glu和Asp釋放增加的幅度。在腦缺血時(shí)，GABA 通過突觸后及突觸前抑制作用，拮抗Glu的毒性，減輕細(xì)胞的損傷［16］。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，Glu／GABA 失衡是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的原因，從而影響大腦的學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知功能［17，18］。本研究中，模型組大鼠海馬組織中ACh、5－HT、DA 含量及其對應(yīng)受體表達(dá)明顯減少，Glu含量及其受體表達(dá)增多，GABA 含量及其受體表達(dá)減少。而補(bǔ)腎活血方組大鼠海馬組織內(nèi)ACh、5－HT、DA 含量及其受體表達(dá)增加，Glu含量及其受體表達(dá)較模型組減少，GABA 含量及其受體表達(dá)增加?？赏茰y，模型組大鼠海馬組織內(nèi)ACh、5－HT、DA 含量及其受體表達(dá)的減少可能與腦內(nèi)EAA／IAA 比值失衡導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷有關(guān)。

補(bǔ)腎活血方具有補(bǔ)腎益髓、活血通脈之功，方中“沙漠人參”肉蓯蓉大補(bǔ)元陽，填精益髓，為君藥；臣以淫羊藿溫腎壯陽，制黃精滋陰益腎；佐以丹參活血通脈。諸藥配合，補(bǔ)中有通，標(biāo)本兼治，共奏補(bǔ)腎益智健腦、活血通脈之功。已有藥理研究表明，方中數(shù)藥可以改善模型動物大腦的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力，并對腦內(nèi)游離氨基酸有作用，可降低缺血缺氧損傷后腦組織中興奮性氨基酸含量，調(diào)節(jié)腦組織中興奮性氨基酸與抑制性氨基酸活性兩類遞質(zhì)的平衡［19－22］?；诒緦?shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，推斷補(bǔ)腎活血方可減輕神經(jīng)元損傷導(dǎo)致的腦內(nèi)ACh、5－HT、DA 含量的減少，保護(hù)大腦學(xué)習(xí)記憶能力，以達(dá)到治療VCI的目的；其機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)腦內(nèi)EAA 與IAA 含量及其受體表達(dá)，改善EAA／IAA 失衡狀態(tài)，降低EAA 興奮性神經(jīng)毒性作用有關(guān)。但補(bǔ)腎活血方改善EAA／IAA 失衡，提高血管性認(rèn)知障礙大鼠認(rèn)知能力的作用機(jī)制尚需更深入的研究探討。

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