杜 柏，胡元會，馬鐵民，劉瑞華，方素萍，吳華芹，褚瑜光，高 揚(yáng)

能量代謝障礙貫穿于心肌從代償性肥大到衰竭的全過程，是心力衰竭（心衰）發(fā)生、發(fā)展和惡化的重要因素之一［1］。研究改善能量代謝的措施，對于防治心衰的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。心復(fù)康口服液是臨床治療氣虛血瘀型充血性心力衰竭的經(jīng)驗(yàn)方。臨床和實(shí)驗(yàn)研究提示［2－4］，心復(fù)康口服液可改善心肌缺血，提高心功能。本實(shí)驗(yàn)通過研究心復(fù)康口服液對心肌梗死后心衰大鼠心肌肌酸激酶能量穿梭中線粒體肌酸激酶（mitochondrialcreatine kinase，mit－CK）mRNA 及mit－CK 蛋白表達(dá)的影響，探討心復(fù)康口服液對心力衰竭時心肌能量代謝轉(zhuǎn)運(yùn)穿梭的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 儀器 HX－300S動物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司），TA1003型精密電子天平（上海天平儀器廠），BL－820S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），HP5500 彩色多普勒超聲顯像儀（PHILIPS美國），YY0103－93冷光單孔手術(shù)燈（上海富眾生物科技有限公司），Bio－Rad CFX96 實(shí)時熒光PCR 儀（Bio－Rad美國），DU 800 分光光度計(jì)（BECKMAN 美國），Bio－Rad電泳儀、multisKan酶標(biāo)儀（Thermo美國）。

1.2 藥物 心復(fù)康口服液（Xinfukan oral liquid，XFK）：由人參、黃芪、丹參、附子、淫羊藿、靈芝等藥物組成，批號：北聯(lián)制字2011FP04006。卡托普利（Captopril）：中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：1112035。

1.3 試 劑 TRIzol，M－MLV Reverse Transcriptase，RNase－OUTTM Ribonuclease Inhibitor（Invitrogen）；pMD18－T Vector、ExTaq 酶 （Takara）；Ampicillin（Sigma）；Super Real Pre Mix（SYBR Green）、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、X－Gal、IPTG、質(zhì)粒提取試劑盒（天根）；DEPC 水（碧云天）；DNA 純化回收試劑盒（廣州東盛）；引物均由Invitrogen公司合成。3 0%凝膠貯備液（Sigma）、SDS、1%TEMED（N，N，N’，N’－四甲基乙二胺）、過硫酸銨（均為Bio－Rad）、考馬斯亮藍(lán)R250（碧云天）、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶 液（KANGLONG），一 抗：Mit－CK（SANTA CRUZ，sc－15169），GAPDH（sigma，g8795），二抗：羊抗（sigma，A5420）、兔抗（abcam）、鼠抗（abcam）。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物 正常雄性SD 大鼠（清潔Ⅱ級），體重200g±20g，60只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證編號：SCXK（京）2007－0001，由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院Ⅱ級動物房分籠飼養(yǎng)，飼以標(biāo)準(zhǔn)的大鼠合成飼料，自由飲用自來水，環(huán)境溫度20 ℃±2 ℃，相對濕度45%～70%。

1.5 動物模型復(fù)制 動物模型制備：參照Pfeffer報(bào)道［5］的方法結(jié)扎冠狀動脈前降支，制備心肌梗死后心衰大鼠模型，術(shù)后每只大鼠肌肉注射青霉素鈉1×105U／d，連續(xù)3d。假手術(shù)組制備：僅在LAD 起始點(diǎn)下2mm～3mm 處針帶線從LAD 下穿過而不結(jié)扎前降支，余步驟與動物模型制備方法相同。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 動物購回后分籠喂養(yǎng)，飼以大鼠標(biāo)準(zhǔn)合成顆粒飼料，保持充分的食物飲水、12h光照、充足通風(fēng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)觀察3d；禁食12h后，按體重均衡，隨機(jī)分為假手術(shù)組（12只）和造模組（48只）。造模組大鼠按動物模型復(fù)制方法造模，造模成功大鼠復(fù)蘇后24h，經(jīng)超聲檢測心功能，以CO值減損15%為充血性心力衰竭（CHF）模型成功，列入造模組，然后再將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、卡托普利組、心復(fù)康組，每組12只大鼠，術(shù)后24h開始灌胃給藥。各組大鼠于給藥后6周末取材，進(jìn)行指標(biāo)檢測。假手術(shù)組：生理鹽水4.0mL／kg灌胃，每日1次；模型組：生理鹽水4.0mL／kg灌胃，每日1次；卡托普利組：卡托普利100mg／kg溶于生理鹽水中灌胃，每日1次；心復(fù)康組：心復(fù)康口服液按5.4g／kg劑量溶于生理鹽水中灌胃，每日1次。

1.7 檢測指標(biāo)和方法

1.7.1 心肌組織mit－CKmRNA 表達(dá)的檢測 灌胃給藥6周末各組大鼠取心肌組織100 mg，保存于－86 ℃。用Real－time RT－PCR方法測定心肌組織mit－CKmRNA。①心肌組織總RNA 的提?。翰捎?mL TRIzol經(jīng)氯仿、異丙醇提取總RNA?？諝飧稍?min～10min，加入DEPC 水20μL，吹吸混勻。分裝，－20 ℃?zhèn)溆?。?μL RNA 溶液，10 倍稀釋，測量A260、A280值，計(jì)算RNA 含量。②逆轉(zhuǎn)錄：Oligo dT，10pmol／μL 1 μL，dNTP 10mmol／L 4μL，RNA 2μg，DEPC水補(bǔ)至12μL；65℃5min，立即放于冰上5 min。在上水管中加入5×First－Strand Buffer 4μL，DTT 0.1 mol／μL 2μL，RNaseOUT.Ribonuclease Inhibitor 40unites／μL 1μL，MMLV 200unites／μL 1 μL?？?共RT 條件：37 ℃50 min，70 ℃15 min。③real－time PCR：引物為mit－CK，creatine kinase，mitochondrial 2，正向引物5′－CAG TGG CTA TAC CCT GGA CC－3′，反向引物5′－AGC CAC CAT GCC CAC AG－3′。實(shí)時PCR 條件：95 ℃，15min；95 ℃10s、60℃和62℃30s×40個循環(huán)；制備溶解曲線：65℃5s，0.5 ℃／s升溫至95 ℃。④標(biāo)準(zhǔn)品制備：吸取2μL 質(zhì)粒樣本，50倍稀釋，測量A260值，計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)。分別稀釋至1×1010copies／μL，再依次10倍稀釋，制備成1×103copies／μL×108copies／μL系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品。

1.7.2 檢測樣本Real－time RT－PCR絕對定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果 樣本RNA 逆轉(zhuǎn)錄（見實(shí)驗(yàn)步驟②逆轉(zhuǎn)錄）產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（見實(shí)驗(yàn)步驟③real－time PCR）。

1.7.3 心肌組織mit－CK 蛋白表達(dá)的檢測 灌胃：給藥6周末各組大鼠取心肌組織100mg，保存于－86 ℃，用Western blotting方法測定心肌組織CK－MM 蛋白。將所取心肌組織研磨成勻漿，測定樣品中蛋白濃度后，用SDS－聚丙烯酰胺緩沖液與蛋白樣品混合，置于水浴鍋中恒溫變性。將變性處理過的蛋白樣品加入濃縮膠中，每孔加蛋白20μg進(jìn)行電泳，電壓10mV。電泳結(jié)束后，將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。轉(zhuǎn)膜條件：恒定電流100mA，NCX 和SERCA 轉(zhuǎn)移2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜放入封閉液中封閉。封閉結(jié)束后膜上蛋白依次與一抗、二抗結(jié)合，一抗結(jié)合過夜，二抗結(jié)合1h。二抗結(jié)合結(jié)束后，在膜上加ECL 化學(xué)發(fā)光底物，反應(yīng)5min 后于暗室內(nèi)將膠片置于轉(zhuǎn)移膜上曝光，顯影、定影后以凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 XFK 對CHF 大 鼠 左 心 室 心 肌mit－CK mRNA 表 達(dá) 的 影響 第6周末，與假手術(shù)組比較，模型組左心室心肌mit－CK 的mRNA 表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，卡托普利組、XFK 組左心室心肌mit－CK mRNA 表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；與卡托普利組比較，XFK 組左心室心肌CK－MMmRNA 表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）。詳見表1。心肌組織mit－CKmRNA Real－time PCR 結(jié)果見圖1～圖3。

圖1 mit－CK mRNA 溶解曲線圖

圖2 mit－CK mRNA 擴(kuò)增曲線圖

圖3 mit－CK mRNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 XFK 對CHF大鼠左心室心肌mit－CK 蛋白表達(dá)的影 響第6周末，與假手術(shù)組比較，模型組左心室心肌mit－CK 的蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，卡托普利組、XFK 組左心室心肌mit－CK 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；與卡托普利組比較，XFK 組左心室心肌mit－CK 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1、圖4。

表1 XFK 對CHF大鼠左心室心肌mit－CK mRNA、蛋白表達(dá)的影響

表1 XFK 對CHF大鼠左心室心肌mit－CK mRNA、蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與卡托普利組比較，3）P＜0.05

組別 mit－CKmRNA mit－CK 蛋白假手術(shù)組 19 796 405±9 143 375 0.98±0.13模型組 7 045 608±232 4521） 0.30±0.141）卡托普利組 18 819 620±5 908 1352） 0.67±0.192）XFK 組 17 231 797±6 037 2522）3） 0.68±0.182）

圖4 XFK 對CHF大鼠左心室心肌mit－CK 蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

肌酸激酶能量穿梭系統(tǒng)是維持心肌能量代謝平衡的重要組成部分，其功能主要是將能量轉(zhuǎn)運(yùn)至肌原纖維并促使能量在肌原纖維中被消耗，從而確保心肌興奮－收縮耦聯(lián)的能量供應(yīng)。該能量穿梭過程可簡要描述為：在mit－CK 的催化下，三磷酸腺苷（ATP）中的高能磷酸鍵被轉(zhuǎn)運(yùn)至肌酸（Cr）中，形成磷酸肌酸（PCr）和二磷酸腺苷（ADP）。PCr是比ATP 小的分子，很快由線粒體彌散入肌原纖維，肌原纖維CK 催化PCr重新形成ATP。從PCr中去除磷酸后形成的游離Cr，通過彌散方式回到線粒體。上述CK 催化的能量反應(yīng)過程被稱為“肌酸激酶能量穿梭系統(tǒng)”［6］。已有報(bào)道顯示，CHF 時肌酸激酶穿梭系統(tǒng)功能明顯受損，CK 活性顯著受抑，其中主要受抑的CK 是CK－MM和mit－CK。在CHF心肌組織中，mit－CK 的活性可下降至正常值的30%～40%，同時CK－MMmRNA 和mit－CKmRNA表達(dá)下調(diào)，CK－MM 和mit－CK 蛋白含量減少，導(dǎo)致ATP轉(zhuǎn)運(yùn)穿梭效率嚴(yán)重下降，細(xì)胞內(nèi)能量流減少，其中轉(zhuǎn)運(yùn)至肌原纖維的能量最多可下降71%。此種能量穿梭功能異常造成心肌收縮功能障礙，尤其是導(dǎo)致心肌收縮功能儲備減少，加劇了CHF 心功能的不斷惡化［7，8］。

本研究結(jié)果提示，心肌梗死后心衰大鼠心臟由于缺血缺氧刺激，mit－CKmRNA 表達(dá)下調(diào)，mit－CK 蛋白含量減少與既往研究結(jié)果一致［8］。卡托普利組心肌梗死后心衰大鼠心肌細(xì)胞mit－CKmRNA 的表達(dá)進(jìn)一步增加，調(diào)控肌酸激酶能量穿梭系統(tǒng)功能，從而導(dǎo)致ATP轉(zhuǎn)運(yùn)穿梭效率改善，細(xì)胞內(nèi)能量流增加，直接促進(jìn)心肌纖維的興奮－收縮耦聯(lián)過程，增強(qiáng)心肌收縮力。起到保護(hù)心衰心肌及心肌能量代謝的作用，達(dá)到保護(hù)心臟功能的目的。益氣活血中藥心復(fù)康口服液組可進(jìn)一步上調(diào)心肌梗死后心衰大鼠心 肌 細(xì) 胞mit－CKmRNA 的 表 達(dá)，促 進(jìn)mit－CK 蛋 白 含 量 增加。表明益氣活血中藥心復(fù)康口服液具有促進(jìn)心肌梗死后心衰大鼠心肌mit－CKmRNA 的表達(dá)，增加mit－CK 蛋白含量，從而改善CHF時肌酸激酶穿梭系統(tǒng)的效率，進(jìn)而影響心肌能量代謝過程，改善心衰引起的心肌能量代謝障礙及心肌功能損傷。

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