李詠，韓梅芳，師愛超，丁琳，陸玉蕾，張元亞，王宏艷，寧琴

·實驗性肝炎·

MHV-3誘導的暴發(fā)性肝炎小鼠肝臟和慢加急性肝衰竭患者外周血單個核細胞TLR2表達的變化*

李詠，韓梅芳，師愛超，丁琳，陸玉蕾，張元亞，王宏艷，寧琴

目的研究慢性乙型肝炎患者和慢加急性乙型肝炎肝衰竭（HBV-ACLF）患者外周血單個核細胞（PBMC）Toll樣受體2 （TLR2）表達，以及鼠三型肝炎病毒（MHV-3）誘導的暴發(fā)性肝炎小鼠肝臟TLR2表達的變化。方法收集慢性乙型肝炎和HBV-ACLF患者外周血，分離PBMC，采用實時定量PCR法檢測PBMC中TLR2 mRNA；給Balb/cJ小鼠腹腔注射MHV-3（100 pfu），建立小鼠暴發(fā)性肝炎模型，觀察感染0、24、48和72 h后肝臟TLR2水平變化。結果BALB/cJ小鼠在感染MHV-3后，與0 h[（0.39±0.06）%]比，肝細胞TLR2 mRNA水平在感染48和72 h均顯著升高[分別為（9.06±1.60）%和（6.42±2.42）%，P＜0.05）]，并于48 h達最高水平，且兩時間點細胞TLR2 mRNA水平均與血清ALT和AST水平呈正相關（r=0.804，P＜0.01；r=0.797，P＜0.01）；HBV-ACLF患者PBMC 中TLR2 mRNA水平顯著高于慢性乙型肝炎患者[（5.92±5.26）% 對（1.15±1.59）%，P＜0.05）]。結論TLR2參與了MHV-3誘導的暴發(fā)性肝炎小鼠以及HBV-ACLF患者肝臟損傷的發(fā)病過程。

暴發(fā)性肝炎；慢加急性肝衰竭；鼠三型肝炎病毒；Toll樣受體2；小鼠

Toll樣受體在天然免疫和后天免疫中都起著至關重要的作用，可以識別病原微生物表達的保守結構基因序列[1]。很多TOLL受體的信號途徑是通過髓樣分化蛋白MyD88介導的[2]。TOLL樣受體的激活可促進相關炎癥和抗炎因子的釋放，激發(fā)機體對病原微生物產(chǎn)生防御反應[3]。Toll樣受體2（Toll-Like receptor 2/TLR2）是TLR家族中的重要成員之一，主要是識別各種病原微生物，如革蘭氏陽性菌、螺旋體和支原體等[4]，而TLR2、3、5與自身免疫性肝炎和酒精性肝病[5]發(fā)生發(fā)展密切相關。TLR4的激活會促進炎性細胞的聚集，產(chǎn)生與炎癥相關的細胞因子[6]?？偟膩碚f，不同的TLR的激活可以導致機體產(chǎn)生不同的抗細菌或病毒的相關免疫反應機制。肝衰竭仍是危害人們健康的疾病之一，并發(fā)癥較多，且病死率較高[7]。雖然近年來取得的一些進展在一定程度上改善了患者預后，但肝衰竭的致病機制尚未完全闡明。目前主要認為免疫系統(tǒng)的過度激活導致大量炎性因子的釋放可能是導致肝衰竭發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。TLR2在肝衰竭發(fā)病中的作用尚未完全闡明。本研究使用鼠三型肝炎病毒（MHV-3）誘導的小鼠肝衰竭模型，采用實時熒光定量PCR法檢測暴發(fā)性肝炎小鼠肝組織TLR2水平，同時檢測了慢性乙型肝炎輕度和乙型肝炎病毒導致的慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）患者外周血單個核細胞（PBMC）TLR2表達的變化，以探討TLR在肝衰竭發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 病毒株MHV-3病毒株為本研究室保存，經(jīng)DBT細胞系空斑純化，利用鼠17CL1細胞系繁殖培養(yǎng)，采用鼠L2細胞系蝕斑純化和滴度測定。本研究所使用的MHV-3滴度為1×106pfu/ml。

1.2 肝衰竭模型的建立取雌性SPF 級Balb/cJ小鼠，6～8 周齡，體質量18～20 g，購自長沙動物實驗中心。動物飼養(yǎng)在本實驗室潔凈層柜（IVC 系統(tǒng)，蘇州馮氏公司）內，恒溫、恒濕，自由食水。MHV-3 以無菌生理鹽水重懸配置，制備感染液。以腹腔注射方式感染小鼠，每只小鼠腹腔注射200 μl 感染液（100 PFU /只）。對照組以無菌生理鹽水以同等劑量注入小鼠腹腔。

1.3 肝組織TLR2 mRNA檢測取肝組織50～100 mg，于1 ml Trizol中碾磨,按Trizol法提取RNA，分光光度計定量，電泳。采用南京金斯瑞公司逆轉錄試劑盒行逆轉錄，取RNA 1 μg，加入OligodT 1 μl，雙蒸水補足至12 μl，70℃水浴10 min，冰上冷卻，再依次加入：逆轉錄混合緩沖液4 μl，1 mmol/L dNTP 1 μl，RNA酶抑制劑2 μl，37℃水浴5 min，后加入逆轉錄酶1 μl，42℃水浴60 min，70℃10 min，滅活終止反應，cDNA置于-20℃保存。采用Real-Time PCR法檢測目的基因：自NCBI基因庫選取小鼠GAPDH、MyD88和TLR2基因，采用Primer 5軟件設計引物，引物由北京擎科公司合成，引物序列如下：小鼠GAPDH，上游；5'-CTCATGACCACAGTCCATGCCATC-3'，下游5'-CTGCTTCACCACCTTCTTG-3'；小鼠TLR2，上游5'-GGGAGCGGCGGCTGGAGGACTCCTA-3'，下游5'-AGGTCGCAGAGACTGCCGTCCAACC-3'；小鼠MyD88，上游5’-GCACCTCAGTACACACA-3’,下游5’-TGATGATAGAACTCTTCCACT-3’；人β-actin，上游5'-CCAACCGCGAGAAGATGA-3'，下游5'-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3'；人TLR2，上游5’-GCGTTCTCTCAGGTGACTGCTCG-3',下游5'-CAGTGAAAGAGCAATGGGCACAA-3'。PCR反應體系為20 μl,采用日本TOYOBO公司試劑盒（QPK201-T），包括上下游引物各1 μl,模板1 μl,SYB 10 μl,加雙蒸水補足至20 μl。反應條件為95℃1 min，95℃15 s，60℃15 s，72℃35 s，40個循環(huán)。

1.4 患者PBMC中TLR2 mRNA檢測本研究經(jīng)同濟醫(yī)院倫理委員會批準?；颊吆炇鹬橥鈺＿x擇的16例慢性肝炎輕度（男11例，女5例，平均年齡36歲）和17例HBV-ACLF患者（男15例，女2例，平均年齡43歲）的診斷均符合2000年西安會議修訂的病毒性肝炎防治方案[8]。取外周血，應用Ficoll密度離心法分離，分離PMBCs，用Trizol裂解，提取RNA，采用Real-Time PCR法檢測TLR2 mRNA水平。

1.5 統(tǒng)計學處理應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行資料分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用ANOVA方差分析或者t檢驗，采用線性回歸分析。P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 MHV-3誘導的Balb/cJ小鼠暴發(fā)性肝炎模型建立成功接受100 pfu MHV-3腹腔注射的10只Balb/cJ小鼠在72 h全部死亡，而接受生理鹽水處理的10只小鼠全部存活。

圖1 MHV-3感染小鼠肝組織MyD88 mRNA水平顯著升高

2.2 MHV-3誘導的Balb/cJ小鼠肝組織MyD88 mRNA水平變化與0 h比，小鼠肝組織MyD88 mR NA水平在48 h顯著升高[（1.85±0.07）% 對（9.90± 2.11）%，P＜0.05，圖1]。2.3 MHV-3誘導的Balb/cJ小鼠肝組織TLR2 mRNA水平變化結果表明，隨著感染時間的延長，與0 h比，感染48 h和72 h時小鼠肝組織TLR2 mRNA水平顯著升高[分別為（0.39±0.06）% 對（9.06± 1.60）%，P＜0.05和（6.42±2.42）%，P＜0.05，圖2]，于感染48 h達到高峰。

圖2 MHV-3感染小鼠肝組織TLR2mRNA水平顯著增高

2.4 MHV-3感染小鼠肝組織TLR2 mRNA水平與血清ALT和AST水平變化密切相關結果顯示，在感染72 h，小鼠肝組織TLR2 mRNA水平與血清ALT或AST水平呈正相關（圖3）。

圖3 MHV-3誘導的暴發(fā)性肝炎小鼠肝組織TLR2 mRNA水平與血清ALT和AST水平的關系（r=0.804，P＜0.01；r=0.797，P＜0.01）

2.5 慢性乙型肝炎輕度和HBV-ACLF患者PBMC中TLR2 mRNA水平變化結果顯示，與慢性乙型肝炎輕度患者比，HBV-ACLF患者PBMC中TLR2 mRNA水平顯著升高[（5.92±5.26）% 對（1.15±1.59）%，P＜0.05，圖4]。

圖4 慢性乙型肝炎輕度與HBV導致的慢加急性肝衰竭患者PBMC中TLR2 mRNA水平比較

3 討論

慢性肝衰竭占我國肝功能衰竭患者總數(shù)的90%。肝衰竭起病快，往往伴隨多種并發(fā)癥，例如腹水、肝性腦病、肝腎綜合征和嚴重感染等，致死率高。該病的發(fā)病機制非常復雜，目前尚未完全闡明。主要觀點普遍認為免疫系統(tǒng)的過度激活導致促炎性因子的大量釋放，進一步導致肝細胞的損傷，全身多器官功能衰竭，最終導致患者死亡[9，10]。Toll樣受體和免疫系統(tǒng)密切相關，Toll樣受體可能在急性肝衰竭中起到重要作用。因此，深入研究TLR與免疫損傷的關系，對深入了解肝衰竭的致病機制有非常重要的意義。

肝臟中的Toll受體通過門靜脈以及相關分支能夠接觸到相應病原體成分，通過激活下游信號轉導而廣泛參與肝臟的生理病理過程。近幾年來，TLRs在肝臟疾病，如病毒性肝炎、酒精性肝病及脂肪性肝病中的作用正被逐步揭示出來。Isogawa et al研究發(fā)現(xiàn)，活化的TLR5、TLR7、TLR9能夠在24小時內通過IFN-α/β依賴途徑抑制HBV復制[11]。Manigold et al發(fā)現(xiàn)TLR2在內毒素血癥的肝硬化患者PBMC中表達上調[12]，而TLR4在Child-Pugh A級肝硬化患者PBMC中顯著下調[13]，提示TLRs可能參與了肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程。

本研究發(fā)現(xiàn)，在未感染的小鼠中，TLR2的表達非常低，但在感染MHV-3后，TLR2在48小時和72小時明顯上調，且在48小時達到峰值。MyD88依賴性信號轉導途徑是TLR信號轉導的共同通路?，F(xiàn)有資料表明TLR2、3、4、7、9信號轉導均通過該途徑完成。在我們的研究中，MyD88和TLR2表達的變化基本是一致的，都是在48小時開始升高，之后回落，提示在感染早期，這一通路起到重要作用。在MHV-3感染小鼠肝衰竭模型中，肝衰竭小鼠TLR2有顯著升高，與肝衰竭患者PBMC中TLR2的高表達有相似之處，提示可以用小鼠肝衰竭模型在一定程度上模擬肝衰竭患者，為以后更進一步的研究打下基礎。

TLRs表達與外來配體的刺激有密切關聯(lián)，TLR2作為與病毒感染關系較為密切的一種模式識別受體，其表達和病毒的感染可能存在一定的相關性，它可以在外界病毒入侵的早期就開始表達上調[4，14，15]。我們的實驗結果說明在病毒感染的初期TLR2迅速被激活。隨著炎癥的不斷進展，TLR2在48小時達到高峰，并于72小時緩慢回落，但仍顯著高于基線水平。我們進一步發(fā)現(xiàn)TLR2在MHV-3感染后不同時間點的表達與小鼠血清ALT和AST水平呈正相關。TLR可以通過激活NF-KB和MAPK通路，促進T細胞增殖和激活，產(chǎn)生大量的細胞因子，如IL-1、IL-6的釋放[14，16，17]。炎性細胞因子的激活被認為在肝衰竭損傷的病理生理中起到重要作用[18～21]，而激活的細胞因子反過來又可以繼續(xù)調節(jié)肝細胞上TLR表達。本研究表明TLR2在肝臟損傷的致病過程中起到了重要的作用。有研究表明，在小鼠體內注射氨基半乳糖和脂質體聯(lián)合注射后，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟中的TLR2 mRNA水平表達有增高，提示TLR2有可能參與了氨基半乳糖和脂質體誘導的肝衰竭[17]，而我們的研究結果與此發(fā)現(xiàn)類似。在外來病毒或者細菌感染過程中，肝細胞損傷可能是過度激活的免疫應答所導致的。TLR2啟動的炎性應答對控制病毒感染可能有限, 但在致死性單純皰疹病毒性腦炎中卻起重要作用。Kurt-Jones et al在單純皰疹病毒腦炎中證實，TLR2 是主要的識別受體，其啟動的炎性應答有助于病毒清除, 但同時也造成嚴重的組織損傷[22]。

本研究在HBV-ACLF患者和慢性乙型肝炎輕度患者發(fā)現(xiàn)TLR2均有表達,但是在慢性乙型肝炎輕度患者其表達明顯偏低。我們的結果與以往的研究有相似之處[23]。由于慢性乙型肝炎輕度患者病情比較穩(wěn)定,在長期慢性化過程中，炎癥反應較弱, 因此體內TLRs未被大量激活,免疫損傷相對較輕，而慢性肝衰竭患者多由慢性肝炎急性進展而來。因此，TLR2被大量激活，同時也造成一定程度的免疫損傷。我們推論,TLR2在慢性肝衰竭發(fā)病機制中的作用可能通過如下途徑實現(xiàn): 在發(fā)病早期通過TLR2對病毒成分的識別而激活免疫應答系統(tǒng)，促進相關炎性因子如IL-6、TNF-α、INF-γ的釋放。在感染過程中，隨時間的推移，肝臟炎癥不斷進展，TLR2對宿主的損傷作用還可能與后期釋放內毒素有關。因此，在肝功能衰竭發(fā)病機制中TLR2的上調既參與了病毒的防御識別，也參與了肝衰竭的致病過程。

通過本研究我們認為：TLR2在肝衰竭發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，TLR2在肝衰竭中的作用將為研究乙型肝炎重癥化的發(fā)病機制開拓新的領域。隨著分子生物學和免疫學的研究不斷進展，TLR2在肝衰竭中的具體作用會不斷被闡明，未來可能為肝衰竭的靶向治療提供新的思路和研究手段。

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（收稿：2014-01-24）

（校對：陳從新）

TLR2 in liver tissues of mice with MHV-3-induced fulminant hepatitis and in peripheral blood mononuclear cells from patients with hepatitis B virus associated acute-on-chronic liver failure

Li Yong，Han Meifang，Shi Aichao，et al.Department and Institute of Infectious Disease，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan，400030，Hubei Province，China

Objective To investigate the toll-like receptor 2 （TLR2）in livers of mice with murine hepatitis virus-3 （MHV-3）-induced fulminant hepatitis and in peripheral blood mononuclear cell （PBMCs）from patients with mild chronic hepatitis B（CHB）or with HBV-associated acute-on-chronic liver failure （HBV-ACLF）. Methods PBMCs from patients with mild CHB and HBV-ACLF were collected. The TLR2 mRNA in PBMCs were determined by quantitative real-time PCR. Balb/cJ mice were injected intraperitoneally with MHV-3 at dose of 100 pfu to induce fulminant hepatitis. At 0，24，48 and 72 h after injection，the TLR2 mRNA in liver tissues of mice were determined. Results After infection of MHV-3，TLR2 mRNA increased significantly at 48 and 72 h when compared with the baseline at 0 h [（0.39±0.06）% vs.（9.06±1.60）%，P＜0.05 and （6.42±2.42）%，P＜0.05] and it peaked at 48 h；mRNA levels for TLR2 at 48 and 72 h were positively correlated with the serum ALT and AST（r=0.804，P＜0.01；r=0.797，P＜0.01，respectively）；mRNA level of TLR2 in PBMCs from patients with HBV-ACLF was significantly higher than patients with mild CHB [（5.92±5.26）% vs.（1.15±1.59）%，P＜0.05]. ConclusionsTLR2 may take part in the process of liver injury in MHV-3-induced fulminant hepatitis in mice and the pathogenesis of patients with HBV-ACLF.

Fulminant hepatitis；Acute-on-chronic liver failure；Murine hepatitis virus-3；Toll-like receptor 2；Mouse

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.03.011

教育部創(chuàng)新團隊項目（編號：IRT1131）

430030 武漢市華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院感染性疾病研究所/感染病科（李詠，韓梅芳，師愛超，丁琳，張元亞，王宏艷）；廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院（陸玉蕾）

李詠，男，32歲，博士研究生。主要從事病毒性肝炎發(fā)病機制研究。E-mail:vamos_yong@hotmail.com

寧琴，E-mail:qning@vip.sina.com