李靜，李毅，劉天會(huì)，尤紅，徐有青

·實(shí)驗(yàn)性肝炎·

重度創(chuàng)傷性腦損傷致應(yīng)激性肝損傷大鼠肝組織細(xì)胞色素P4502El水平變化

李靜，李毅，劉天會(huì)，尤紅，徐有青

目的研究重度創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）誘導(dǎo)的應(yīng)激性肝損害（HSI）大鼠肝組織細(xì)胞色素P4502El（CYP2E1）的變化。方法取40只健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)(A組)和TBI組，采用改良的Feeney自由落體撞擊法建立TBI大鼠模型；于顱腦致傷后6、12和24 h，檢測(cè)各組血清ATL、AST水平和丙二醛（MDA）水平變化，在光鏡下觀察肝臟組織學(xué)改變，采用RT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)各組肝組織CYP2E1 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果在TBI后6和24 h，各組大鼠血清ALT較基線水平[（42.2±8.1）U/L]明顯升高[分別為（83.0± 10.3）U/L和（1204.5±146.6）U/L，P＜0.01）]；傷后12 h血清AST較基線[（44.0±7.2）U/L]升高[（280.4±53.3）U/L，P＜0.01）]，于24 h達(dá)峰值[（790.3±114.5）U/L]；傷后6 h MDA較基線[（5.2±0.2）nmol/mg]明顯升高[（14.2±0.2）nmol/mg，P＜0.05]，24 h達(dá)峰值[（56.3±0.5）nmol/mg]；傷后24 h肝組織損傷最嚴(yán)重，可見肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝竇明顯擴(kuò)張，散在肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；傷后6 h肝組織CYP2E1 mRNA和蛋白表達(dá)水平較基線水平[分別為（0.28±0.02）和（61.68±0.60）]明顯增加[（0.89±0.05）和（120.24±1.22），P＜0.05]，在24 h達(dá)峰值[分別為（1.50±0.02）和（200.40±2.61），P＜0.01]。結(jié)論CYP2E1可能參與了TBI誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而引起HSI。

肝損傷；應(yīng)激反應(yīng)；細(xì)胞色素P4502El；氧化應(yīng)激；大鼠

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI），尤其是重度TBI后常發(fā)生應(yīng)激性肝損害（hepatic stress injury，HSI）等內(nèi)臟并發(fā)癥[1]。目前，HSI的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，多認(rèn)為是由內(nèi)毒素血癥、炎癥性介質(zhì)、氧自由基、細(xì)胞凋亡等多因素參與、多種炎癥介質(zhì)共同作用的復(fù)雜的病理生理過(guò)程[2，3]。氧化應(yīng)激是指因抗氧化機(jī)制受損引發(fā)的自由基和活性氧與蛋白、脂質(zhì)或核酸等體內(nèi)高分子反應(yīng)，致使后者的結(jié)構(gòu)、功能出現(xiàn)損害的狀態(tài)[4]。細(xì)胞色素P4502El（cytochrome P4502El，CYP2E1）可介導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化[5～7]，而CYP2E1的表達(dá)受多因素調(diào)控，在酒精性肝病、非酒精性肝病中均有一定的作用。本研究探討了在重度創(chuàng)傷性腦損傷導(dǎo)致的大鼠應(yīng)激性肝損傷中CYP2E1的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量為200～250 g，由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所動(dòng)物中心提供。脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所?？俁NA提取試劑盒、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、寡聚胸腺嘧啶引物、瓊脂糖均購(gòu)自美國(guó)Promega公司。Taq酶和PCR分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自北京天為時(shí)代公司。兔抗大鼠CYP2E1多克隆抗體（ab53945）購(gòu)自美國(guó)ABcam公司。zb-230辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司?；瘜W(xué)發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。FuGENEHD轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自德國(guó)羅氏公司。

1.2 TBI模型制備將40只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組）和TBI組（B組），再根據(jù)術(shù)后6 h、12 h和24 h分成B6、B12和B24組，每組大鼠10只。采用改良的Feeney[3]自由落體撞擊法建立TBI模型。應(yīng)用3%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，俯臥位固定于顱腦立體定位儀上，取頭皮正中矢狀切口，用骨膜剝離器輕輕剝離骨膜，暴露左側(cè)冠狀縫及人字縫部，自人字縫前、中線左側(cè)2 mm處開窗，將撞桿系統(tǒng)置于硬膜外，撞擊面積為0.1 cm2，撞擊力度為20 N/cm2，將20 g砝碼從50 cm高度落下，致傷力約為100 kPa，相當(dāng)于臨床重度腦損傷[5]，縫合頭皮。在假手術(shù)大鼠只開骨窗，不予落體撞擊。各組大鼠均于術(shù)后48 h處死，自左心室取血，取肝組織200 mg備檢。

1.3 血清ATL和AST檢測(cè)采用Reitman氏法檢測(cè)。

1.4 肝組織MDA檢測(cè)取肝組織勻漿，參照南京建成生物研究所提供的MDA測(cè)定試劑盒的操作步驟進(jìn)行。

1.5 肝組織病理學(xué)檢查取大鼠肝臟組織，石蠟切片，HE染色，在光鏡下觀察組織學(xué)改變。

1.6 肝組織CYP2El mRNA檢測(cè)采用RT-PCR法，取肝組織200 mg，制備組織勻漿，提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。設(shè)計(jì)CYP2El引物如下：上游：5’-TCATAGCCGACATCCTCTTC-3’，下游：5’-GTTGTGCTGGTGGTCTCTGT-3’。PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為367 bp。PCR反應(yīng)條件為:95℃5 min;94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。以磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參照，計(jì)算比值。

1.7 肝組織CYP2El蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blot法，取肝組織200 mg，制備組織勻漿，加蛋白裂解液處理并制備蛋白樣品。將蛋白樣品在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以封閉液在室溫振蕩下封閉2 h，加入以封閉液稀釋的第一抗體（1:2500），4℃冰箱過(guò)夜，加吐溫-三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖鹽溶液洗滌，每次10 min，加l:2000稀釋的第二抗體于室溫下孵育2 h，加吐溫-三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖鹽溶液洗滌，每次10 min，加發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS l3.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用One-way ANOVA單因素方差分析，P＜O.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠創(chuàng)傷前后血清酶學(xué)的變化在制備TBI后6 h，各組大鼠血清ALT明顯升高，24 h達(dá)峰值水平；于TBI后12 h AST開始升高，24 h達(dá)峰值水平。各個(gè)TBI大鼠血清ALT、AST均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，表1）。

2.2 大鼠創(chuàng)傷前后肝組織MDA變化在TBI后6 h，大鼠肝組織MDA水平明顯升高，24 h達(dá)峰值，各個(gè)TBI組MDA水平與對(duì)照組均有顯著性差異（P＜0.05，表1）。

表1 各組大鼠血清ALT、AST和肝組織MDA水平（±s）比較

表1 各組大鼠血清ALT、AST和肝組織MDA水平（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05；②P＜0.01

只數(shù)ALT（U/L）AST（U/L）MDA（nmol/mg）A組1042.2±8.144.0±7.25.2±0.2 B6組1083.0±10.3①53.3±10.214.2±0.2①B12組10244.5±63.4②280.4±53.3②17.5±0.3①B24組101204.5±146.6②790.3±114.5②56.3±0.5②

2.3 肝組織學(xué)表現(xiàn)A組動(dòng)物肝組織在光鏡下肝小葉排列清晰，肝竇無(wú)擴(kuò)張，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，胞漿清晰，胞核完整，無(wú)腫脹、變性、壞死，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1）；B6組肝組織可見部分細(xì)胞水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2）；B12組在損傷后12 h可見細(xì)胞空泡變性，胞漿疏松，偶可見點(diǎn)狀壞死，有較多的灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)尚完整（圖3）；B24組可見肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝竇明顯擴(kuò)張，肝細(xì)胞大部分濁腫，胞漿疏松，可見脂滴，肝細(xì)胞散在點(diǎn)狀壞死，多處灶性壞死，細(xì)胞膜融合消失，細(xì)胞核破碎，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4）。

圖1 正常大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn)（HE，200×）

圖2 B6組大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn)（HE，200×）

圖3 B12組大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn)（HE，200×）

圖4 B24組大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn)（HE，200×）

2.4 肝組織CYP2El表達(dá)情況A組肝組織CYP2E1 mRNA和蛋白表達(dá)水平最低，在模型組于傷后6 h開始升高，48 h達(dá)峰值，組間差異有顯著性意義（P＜0.01，表2和圖5、6）。

表2 各組肝組織CYP2E1 mRNA和蛋白（CYP2E1/GAPDH，±s）表達(dá)情況

表2 各組肝組織CYP2E1 mRNA和蛋白（CYP2E1/GAPDH，±s）表達(dá)情況

與對(duì)照組比，①P＜0.05；②P＜0.01

只數(shù)CYP2E1 mRNACYP2E1蛋白A組30.28±0.0261.68±0.60 B6組30.89±0.05②120.24±1.22①B12組31.07±0.03②154.53±0.32②B24組31.50±0.02②200.40±2.61②

圖6 各組肝組織CYP2E1蛋白表達(dá)情況

3 討論

本組實(shí)驗(yàn)顯示大鼠TBI后6 h即有血清肝酶升高和肝臟組織學(xué)改變,并隨病程延長(zhǎng)肝損害由變性到壞死呈逐漸加重趨勢(shì),符合TBI后HSI表現(xiàn)。關(guān)于HSI的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,可能是氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、缺血再灌注損傷等多因素共同作用的結(jié)果[8]。其中氧化應(yīng)激可能是重要機(jī)制之一。有研究[3]顯示缺血再灌注損傷可引起大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）。當(dāng)ROS的產(chǎn)生過(guò)多超過(guò)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)清除能力時(shí)，過(guò)多的ROS可攻擊鄰近組織、細(xì)胞，引起DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化或再氧化損害，破壞細(xì)胞和功能的完整性，產(chǎn)生氧化應(yīng)激[5，13～15]。氧化應(yīng)激反過(guò)來(lái)又可誘導(dǎo)多種紊亂和呼吸爆發(fā)，進(jìn)一步加重組織的缺血缺氧和臟器的損傷[16]。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞有3個(gè)部位可產(chǎn)生ROS，即線粒體、微粒體、過(guò)氧化物酶體，其中大量ROS使肝細(xì)胞膜脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物[9，17，18]。MDA是重要的脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)物之一，其含量可反映組織過(guò)氧化程度。本實(shí)驗(yàn)顯示肝組織MDA于TBI后6 h明顯升高，24 h達(dá)峰值，與肝酶及肝組織病理學(xué)改變一致。

細(xì)胞色素CYP450是位于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一組混合功能氧化酶系，已確定的人類CYP450同功酶有20多種，其中CYP2E1是最主要的同功酶，其表達(dá)水平與代謝活性相關(guān)，受體內(nèi)外諸多因素的影響，其代謝底物可誘導(dǎo)該酶本身的生成，它是微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的催化劑[10]。本實(shí)驗(yàn)顯示大鼠TBI后6 h開始，CYP2E1 mRNA及蛋白均較對(duì)照組表達(dá)明顯增強(qiáng)，并在24 h達(dá)峰值，證實(shí)CYP2E1表達(dá)增強(qiáng)的程度和HSI損傷程度與組織過(guò)氧化程度相關(guān)，故提示CYP2E1參與了HSI中氧化應(yīng)激反應(yīng)。

CYP2E1介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化主要表現(xiàn)在以下幾方面：（1）肝細(xì)胞內(nèi)蓄積的游離脂肪酸可誘導(dǎo)CYP2E1活性增加[17]；（2）在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)存在自由基清除劑即氧化劑，如超氧化物歧化酶/谷胱甘肽等，可以隨時(shí)清除不斷生成的有害自由基，阻斷自由基的鏈?zhǔn)椒糯蠓磻?yīng)，從而保護(hù)細(xì)胞作用。隨著CYP2E1表達(dá)的增強(qiáng)，抗氧化劑SOD的含量顯著下降，提示脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的增強(qiáng)和抗氧化劑能力下降，將導(dǎo)致自由基氧化細(xì)胞膜的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)反應(yīng)，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損害[18]；（3）CYP2E1的過(guò)表達(dá)可造成肝毒性和線粒體的損傷，同時(shí)有CYP2E1產(chǎn)生的活性氧通過(guò)擴(kuò)散作用，激活肝星狀細(xì)胞，形成肝纖維化[19]；（4）CYP2E1過(guò)表達(dá)與脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物顯著相關(guān)，還可誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞激活并增加炎癥因子釋放，CYP2E1抑制劑可阻止肝星狀細(xì)胞活化，這些都表明CYP2E1表達(dá)增強(qiáng)是氧化損傷、炎癥和肝纖維化進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)[20～22]。

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（收稿：2014-01-16）

（校對(duì)：陳從新）

Dynamic changes of cytochrome P4502El in liver tissues of rats with hepatic stress injury secondary to traumatic brain injury

Li Jing,Li Yi，Liu Tianhui，et al.Department of Gastroenterology，TiantanHospital，Affiliated to Capital Medical University，Beijing，100050，China

ObjectiveTo explore the dynamic changes of cytochrome P4502El（CYP2E1）in liver tissues of rats with hepatic stress injury（HSI）secondary to traumatic brain injury（TBI）.MethodsForty healthy male Wistar rats were randomly divided into sham-operated and TBI group.The animal model was established by an improved Feeney method.Serum levels of ALT and AST were measured by enzymatic assay at 6，12 and 24 h after TBI；MDA contents in liver tissues were also measured.Pathological changes of liver tissues were observed under light microscopy.The CYP2E1 mRNA levels and its protein expression were detected by RT-PCR and Western blot，respectively.ResultsAt 6 h and 24 h after TBI，serum ALT elevated significantly[（83.0±10.3）U/ L and（1204.5±146.6）U/L，respectively，P＜0.01）]as compared with baseline[（42.2±8.1）U/L]；at 12 h after TBI，serum AST elevated significantly[（280.4±53.3）U/L，P＜0.01）]compared with baseline[（44.0±7.2））U/L]，and it peaked at 24 h[（790.3±114.5）U/L]；at 6 h after TBI，serum MDA elevated significantly[（14.2±0.2）nmol/mg，P＜0.05]compared with baseline[（5.2±0.2）nmol/mg]，and it peaked at 24 h after TBI[（56.3±0.5）nmol/mg]；at 24 h after TBI，the injuries in liver tissues were serious，with expanded sinus，scattered spotty necrosis and inflammatory cell infiltration；at 6 h after TBI，both mRNA and protein levels of CYP2E1 were significantly elevated[（0.89± 0.05）and（120.24±1.22），P＜0.05]compared with baseline[（0.28±0.02）and（61.68±0.60），respectively]，and they peaked at 24 h after TBI[（1.50±0.02）and（200.40±2.61），respectively，P＜0.01].ConclusionsCYP2E1 may be involved in oxidative stress in hepatic stress injury after TBI.

Hepatic stress injury；Cytochrome P4502El；Oxidative stress；Rats

100050北京市首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院消化內(nèi)科（李靜，徐有青）；附屬北京友誼醫(yī)院肝病實(shí)驗(yàn)中心（劉天會(huì)，尤紅）；遂寧市中心醫(yī)院感染病科（李毅）

李靜，女，30歲，碩士研究生，住院醫(yī)師。E-mail:185887400@qq.com

徐有青，E-mail:youqingxu@hotmail.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.05.017