王文超，周歡，余垚，呂紅

1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

2. 上海市工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心，上海 200433

組蛋白H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物亞基Ash2參與裂殖酵母產(chǎn)孢

王文超1,2，周歡1,2，余垚1,2，呂紅1,2

1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

2. 上海市工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心，上海 200433

在氮源缺乏及信息素存在的條件下，裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)進(jìn)行減數(shù)分裂并完成產(chǎn)孢。在此過(guò)程中，信息素介導(dǎo)的MAPK(Mitogen-activated protein kinases)信號(hào)通路調(diào)控減數(shù)分裂相關(guān)基因的表達(dá)。Spk1是MAPK通路的核心成員，通過(guò)蛋白磷酸化的方式激活轉(zhuǎn)錄因子Ste11，從而激活mei2+、mam2+和map3+等減數(shù)分裂相關(guān)基因的表達(dá)。盡管組蛋白H3K4甲基化參與基因轉(zhuǎn)錄激活、染色質(zhì)重塑等諸多生物學(xué)過(guò)程，但其在裂殖酵母產(chǎn)孢過(guò)程中的作用并不清楚。文章通過(guò)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)裂殖酵母Ash2作為H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物COMPASS的亞基具有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，定位于細(xì)胞核內(nèi)參與H3K4的甲基化修飾。ash2+的缺失引起裂殖酵母在氮源缺乏時(shí)產(chǎn)孢過(guò)程的延遲及產(chǎn)孢率下降。ChIP、定量PCR分析結(jié)果顯示，ash2+的缺失降低了spk1+編碼區(qū)H3K4的二甲基化水平，造成spk1+mRNA水平的明顯下調(diào)。在ash2Δ細(xì)胞中，雖然ste11+的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有變化，但Ste11的靶基因mei2+、mam2+和map3+的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。在裂殖酵母中，組蛋白H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物COMPASS的亞基Ash2通過(guò)調(diào)控二甲基化水平修飾從而調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路，參與裂殖酵母的有性生殖，為建立表觀遺傳修飾與減數(shù)分裂之間的聯(lián)系提供了新的線索。

裂殖酵母；H3K4甲基化；Ash2；產(chǎn)孢；MAPK

在適宜環(huán)境中，裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)以有絲分裂的方式進(jìn)行無(wú)性繁殖。與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下發(fā)生細(xì)胞接合的情況不同，裂殖酵母只有在環(huán)境營(yíng)養(yǎng)缺乏尤其是氮源缺乏時(shí)，才能發(fā)生細(xì)胞接合。細(xì)胞接合發(fā)生在具有相反交配型的h+和h-細(xì)胞之間，產(chǎn)生二倍體合子。合子進(jìn)行減數(shù)分裂并產(chǎn)生 4個(gè)單倍體孢子，孢子等待適宜的環(huán)境進(jìn)行萌發(fā)[1]。裂殖酵母從有絲分裂進(jìn)入減數(shù)分裂的過(guò)程被多條信號(hào)途徑所操縱，其中包括信息素介導(dǎo)的 MAPK(Mitogenactivated protein kinases)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。MAPK途徑是由膜上的G蛋白耦聯(lián)受體和一系列蛋白激酶所構(gòu)成的經(jīng)典級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。通常情況下，G蛋白耦聯(lián)受體接受外界信號(hào)，激活胞漿中MAPKK激酶(MEKK)，MEKK通過(guò)磷酸化激活MAPK激酶(MEK)，然后MEK通過(guò)磷酸化激活MAPK。激活的MAPK進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子，起始相關(guān)基因表達(dá)，從而對(duì)外界信號(hào)做出回應(yīng)[2]。裂殖酵母信息素途徑主要由Map3/Mam2(G蛋白耦聯(lián)受體)、Byr2(MEKK)、Byr1(MEK)和Spk1(MAPK)組成。在氮源缺乏的情況下，h+和 h-細(xì)胞分泌信息素，信息素被Map3或Mam2識(shí)別，隨后Byr2、Byr1和Spk1被依次激活。Spk1通過(guò)磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子Ste11[3]，Ste11隨后激活交配型基因matP+、matM+和減數(shù)分裂必需基因 mei2+的轉(zhuǎn)錄[4,5]，從而誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)氮源缺乏的環(huán)境做出應(yīng)答，啟動(dòng)細(xì)胞接合以及下游的減數(shù)分裂過(guò)程。對(duì)于MAPK途徑的調(diào)控存在多種方式，例如：通過(guò)改變蛋白激酶的構(gòu)象來(lái)影響其磷酸化能力，如調(diào)節(jié)因子Ste4與Byr2(MAPKKK)直接結(jié)合，通過(guò)影響B(tài)yr2二聚體的形成來(lái)調(diào)節(jié)MAPK途徑[6]；此外，通過(guò)改變蛋白激酶的胞內(nèi)定位來(lái)影響它的磷酸化，如14-3-3家族蛋白R(shí)ad24和Rad25與Byr2結(jié)合，促進(jìn) Byr2從胞漿定位到質(zhì)膜，從而實(shí)現(xiàn)Map3/Mam2(GPCR)對(duì)Byr2的磷酸化[7]。通過(guò)影響蛋白激酶的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控MAPK通路的研究相對(duì)較少。

COMPASS是一個(gè)在真核生物中高度保守的蛋白復(fù)合物，通過(guò)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在應(yīng)激、凋亡、發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。COMPASS的核心亞基為Set1，具有組蛋白H3K4的甲基化轉(zhuǎn)移酶活性[8]，參與組蛋白 H3K4一甲基(me)、二甲基(me2)和三甲基(me3) 3種層次的修飾[9]，其中酵母中H3K4二甲基化主要分布于基因編碼區(qū)域，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[10,11]。除了 Set1，COMPASS復(fù)合物還包括多個(gè)重要的亞基，如Ash2、RBBP5、WDR5和hDPY30等[12]。研究發(fā)現(xiàn)，COMPASS復(fù)合物的亞基參與了產(chǎn)孢過(guò)程的調(diào)控。例如，在釀酒酵母中，COMPASS復(fù)合物酶學(xué)亞基Set1的缺失延緩了減數(shù)分裂期間的DNA復(fù)制，從而導(dǎo)致產(chǎn)孢效率的下降，該調(diào)節(jié)過(guò)程并不依賴 COMPASS的甲基化酶活性[13]。COMPASS亞基Spp1可以與DNA雙鏈斷端(DSB)蛋白Mer2直接結(jié)合，促進(jìn)了DSB的形成和減數(shù)分裂重組，推動(dòng)了產(chǎn)孢過(guò)程[14]。上述研究結(jié)果提示，COMPASS復(fù)合物采用了多種機(jī)制參與調(diào)控產(chǎn)孢過(guò)程。

Ash2(Absent, small, or homeotic discs 2)屬于trithorax-group (trxG)家族，在進(jìn)化上相當(dāng)保守，很多真核生物中都擁有 Ash2的同源蛋白。在果蠅(Drosophila melanogaster)中，ASH2的缺失突變降低了發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的 H3K4三甲基化，從而影響了該基因的轉(zhuǎn)錄激活，造成果蠅翅膀的缺刻的變化[15]。果蠅的ASH2可以與SKTL(磷脂酰肌醇4-磷酸-5激酶)直接結(jié)合，兩者的同時(shí)缺失會(huì)引起多線染色體中H1的過(guò)磷酸化[16]。ASH2L是Ash2的人類同源蛋白，它在胚胎早期發(fā)育和心臟發(fā)育中起到重要作用[17]。ASH2L也是一個(gè)原癌基因，它的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在釀酒酵母中，Ash2同源蛋白BRE2作為COMPASS復(fù)合物的亞基，定位于細(xì)胞核中，調(diào)控組蛋白H3K4的甲基化修飾[9]。相對(duì)于其他物種，裂殖酵母Ash2的功能研究還很少。

本研究發(fā)現(xiàn) ash2+缺失會(huì)引起裂殖酵母產(chǎn)孢缺陷，通過(guò)熒光定位和Western blot發(fā)現(xiàn)Ash2定位于細(xì)胞核內(nèi)參與 H3K4甲基化修飾。通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)和定量 PCR揭示了 Ash2通過(guò)調(diào)控MAPK途徑成員的轉(zhuǎn)錄水平，影響了MAPK途徑靶基因的表達(dá)。本研究為建立表觀遺傳修飾與減數(shù)分裂之間的聯(lián)系提供了新的線索。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所使用的裂殖酵母菌株見(jiàn)表 1。E. coli DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。用于產(chǎn)孢研究的野生型菌株h90的基因座上有兩種交配型基因，可以在繁殖過(guò)程中表現(xiàn)出h+或是h-的性狀，正常環(huán)境中，h90菌株進(jìn)行無(wú)性生殖，當(dāng)環(huán)境中氮源缺乏時(shí)，在細(xì)胞群落中h90可以進(jìn)行同宗交配[18]。裂殖酵母基因同源敲除質(zhì)粒CHGL、紅色熒光整合質(zhì)粒FAML均為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存。兩種質(zhì)粒均通過(guò)改造pCloneHyg1質(zhì)粒獲得，帶有潮霉素抗性序列(HygR)篩選標(biāo)記。酵母的常規(guī)培養(yǎng)基YES及培養(yǎng)條件參見(jiàn)文獻(xiàn)[18]，酵母接合產(chǎn)孢培養(yǎng)基EMM-N配方參見(jiàn)文獻(xiàn)[19]。

1.2 方法

1.2.1 基因敲除菌株及熒光菌株構(gòu)建

采用同源重組的方式在h90菌株中敲除ash2+。用于擴(kuò)增ash2+上游同源區(qū)域引物對(duì)為Ash2-KO-Up-F/ Ash2-KO-Up-R，擴(kuò)增下游同源區(qū)域引物對(duì)為 Ash2-KO-Down-F/Ash2-KO-Down-R，用于驗(yàn)證敲除的上游引物對(duì)為up5'/CR，下游引物對(duì)為CF/dw3'。構(gòu)建流程圖見(jiàn)圖1。PCR分別擴(kuò)增裂殖酵母ash2+的上游序列(up)和下游序列(dw)，并引入圖示酶切位點(diǎn)。將up片段和dw片段雙酶切后分別裝入pCHGL敲除質(zhì)粒，獲得用于中斷ash2+的質(zhì)粒pCHGL-Ash2，將質(zhì)粒用SalⅠ單酶切線性化后轉(zhuǎn)入野生型h90菌株中，上下游序列將與基因組上的同源區(qū)域發(fā)生同源重組，使ash2+被潮霉素抗性基因中斷盒(hphMX4)所替換。隨后利用潮霉素篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。通過(guò)類似的同源重組策略在 ash2+3′端融合紅色熒光蛋白(RFP)標(biāo)簽，獲得了表達(dá) Ash2-RFP融合蛋白的菌株。用于擴(kuò)增融合區(qū)域上游同源區(qū)域的引物對(duì)為 Ash2-RFPUP-F/Ash2-RFP-UP-R，擴(kuò)增下游同源區(qū)域的引物對(duì)為Ash2-RFP-DW-F/Ash2-RFP-DW-R。引物信息見(jiàn)表2。

表1 本研究使用的裂殖酵母菌株

圖1 ash2+缺失突變體的構(gòu)建流程

表2 引物序列

1.2.2 顯微鏡觀察

將 WC2(Ash2-RFP)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600= 1.0左右)進(jìn)行活細(xì)胞觀察，利用IX51基礎(chǔ)型倒置顯微鏡(Olympus公司)的微分干涉(DIC)明場(chǎng)觀察酵母細(xì)胞形態(tài)，利用WIGA通道觀察Ash2-RFP紅色熒光信號(hào)，利用WU通道觀察Hoechst的信號(hào)。采用DP2-BSW軟件拍攝及分析細(xì)胞圖片。

1.2.3 裂殖酵母組蛋白抽提

將F274(wt)、LHP2(ash2Δ)和LHP3(set1Δ)分別接種于50 mL YES液體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)至OD600大于 1.0。離心收集菌體后，用含有蛋白酶抑制劑(Roche)的NIB buffer(0.25 mol/L蔗糖、60 mmol/L KCl、15 mmol/LNaCl、5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L CaCl2、15 mmol/L Pipes，pH6.8、0.8% Triton X-100)重懸。采用玻璃珠震蕩破碎菌體，加入 500 μL 0.4 mol/L H2SO4，靜置1 h。離心取上清，加入12倍體積的預(yù)冷丙酮沉淀蛋白。離心收集沉淀并風(fēng)干，用100 μL 4 mol/L尿素重懸沉淀，加入6×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用anti-H3K4me、anti-H3K4me2和anti-H3K4me3抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，用anti-H3檢測(cè)作為內(nèi)參。

1.2.4 產(chǎn)孢效率檢測(cè)

為了檢測(cè)在液體培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢效率，將LHP1(h90)和WC1(h90ash2Δ)接種于YES中，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期。使用EMM-N將菌體洗滌3次后轉(zhuǎn)接至50 mL EMM-N液體培養(yǎng)基，初始OD600=0.2。每4 h取樣進(jìn)行產(chǎn)孢效率的統(tǒng)計(jì)，并繪制產(chǎn)孢曲線。產(chǎn)孢效率計(jì)算公式參考文獻(xiàn)[6]。

為了檢測(cè)在固體培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢效率，將野生型LHP1(h90)和WC1(h90ash2Δ)接種于YES中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期，使用EMM-N將菌體洗滌3次。將菌液濃度調(diào)至 OD600=1，取 5 μL菌液點(diǎn)種于EMM-N固體培養(yǎng)基上。25℃培養(yǎng)3 d后，用碘蒸汽對(duì)孢子進(jìn)行染色，使用奧林巴斯IX51倒置顯微鏡拍攝，并統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢效率，產(chǎn)孢效率計(jì)算公式參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.5 RNA提取及定量PCR

將LHP1(h90)和WC1(h90ash2Δ)接種于YES中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用EMM-N清洗菌體3次，轉(zhuǎn)接至50 mL EMM-N培養(yǎng)基中，初始OD600=0.2，25℃培養(yǎng)12h。離心收集細(xì)胞(約1×108個(gè))，采用酵母RNA抽提試劑盒(Ambion)抽提 RNA，利用反轉(zhuǎn)試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，隨后采用SYBR premix Ex-Taq (TaKaRa)和 LightCycler480(羅氏)進(jìn)行定量PCR分析，以 act1+作為內(nèi)參。定量 PCR所用引物的序列參見(jiàn)表2。

1.2.6 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)

將LHP1(h90)和WC1(h90ash2Δ)接種于YES中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用EMM-N清洗菌株3次，轉(zhuǎn)接至50 mL EMM-N培養(yǎng)基中，初始OD600=0.2，25℃培養(yǎng)12 h后，離心收集細(xì)胞(約3×108個(gè))。用1%的甲醇在25℃固定20 min，加入終濃度為150 mmol/L的甘氨酸終止固定。收集細(xì)胞，用Buffer I (50 mmol/L HEPES (pH7.5)、140 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1% TritonX-100和0.1% Na-deoxycholate)清洗兩次后，用含有蛋白酶抑制劑(Roche)的Buffer I重懸菌體。用玻璃珠振蕩器破菌。用超聲破碎儀在冰上對(duì)裂解液處理15 min打斷DNA。對(duì)裂解液離心后取上清，采用EZ-Magna ChIP試劑盒(Millipore)進(jìn)行ChIP，所用抗體為anti-H3K4me2(Millipore 05-1338)。利用Real-time PCR對(duì)ChIP所得到的DNA進(jìn)行分析，以fbp1+作為內(nèi)參，所用引物的序列參見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂殖酵母Ash2蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

裂殖酵母ash2+基因位于II號(hào)染色體，編碼區(qū)全長(zhǎng)1959 bp。SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)在線分析結(jié)果顯示，Ash2含有兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，分別位于42～92位氨基酸的PHD結(jié)構(gòu)域和330～519位氨基酸的SPRY結(jié)構(gòu)域(圖2A)。利用DNAMAN軟件對(duì)釀酒酵母、裂殖酵母、果蠅(D.melanogaster)、小鼠(M.musculus)及人類(H.sapiens)的 Ash2同源蛋白進(jìn)行了全長(zhǎng)序列比對(duì)。結(jié)果顯示，Ash2同源蛋白中均含有保守的鋅指PHD和SRPY結(jié)構(gòu)域(圖2B，黑框)，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可能發(fā)揮了保守的生物學(xué)功能。

2.2 裂殖酵母ash2+缺失突變體的構(gòu)建

為了研究裂殖酵母Ash2的功能，本研究利用同源重組的方法在 LHP1(h90)菌株中構(gòu)建了 ash2+的缺失突變體。利用圖1所示的up5'/CR和CF/dw3'兩對(duì)引物對(duì)獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明ash2+被含有潮霉素抗性基因的中斷盒所替換(圖 3)，從而獲得了ash2+缺失突變體菌株WC1(h90ash2Δ)。

2.3 裂殖酵母Ash2的定位及對(duì) H3K4甲基化修飾的影響

為了探究在裂殖酵母Ash2蛋白是否參與H3K4的甲基化修飾，本研究首先檢測(cè)了Ash2在細(xì)胞內(nèi)的定位。采用同源重組策略，在裂殖酵母野生型菌株wt的ash2+基因座位的C端融合了RFP，獲得了表達(dá)內(nèi)源性的 Ash2-RFP熒光蛋白的菌株 WC2 (Ash2-RFP)。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，Ash2主要分布在細(xì)胞核內(nèi)(圖4A)。

比較了野生型細(xì)胞wt和ash2Δ細(xì)胞中的H3K4一、二、三基化修飾水平，以組蛋白 H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物核心酶學(xué)亞基Set1作為對(duì)照。結(jié)果表明，當(dāng)ash2+缺失時(shí)，H3K4me3水平完全喪失，H3K4me2水平相比于野生型明顯降低。作為對(duì)照，COMPASS復(fù)合物酶學(xué)亞基Set1的缺失，導(dǎo)致了所有3個(gè)層次的甲基化修飾的完全喪失(圖 4B)。以上研究表明，裂殖酵母Ash2主要參與調(diào)控了H3K4二、三甲基化修飾。

圖2 5種真核生物Ash2同源蛋白多序列比對(duì)A：裂殖酵母Ash2蛋白的PHD和SPRY結(jié)構(gòu)域；B：釀酒酵母、裂殖酵母、果蠅、小鼠及人中Ash2同源蛋白的序列比對(duì)。黑框表示物種間保守的結(jié)構(gòu)域。

圖3 裂殖酵母ash2+缺失突變體的PCR鑒定1：up5'/dw3'引物對(duì)鑒定(up5'位于 ash2+上游 100 bp，dw3'位于ash2+下游100 bp處，潮霉素中斷盒篩選標(biāo)記為1600 bp，PCR擴(kuò)增獲得與預(yù)期一致的1800 bp片段)；2：up5'/CR引物對(duì)鑒定(CR為潮霉素中斷盒篩選標(biāo)記內(nèi)部反向引物，PCR擴(kuò)增獲得與預(yù)期一致的510 bp片段)；3：CF/dw3'引物對(duì)鑒定(CF為潮霉素中斷盒篩選標(biāo)記內(nèi)部正向引物，PCR擴(kuò)增獲得與預(yù)期一致的620 bp片段)。

2.4 ash2+缺失導(dǎo)致產(chǎn)孢的延遲和產(chǎn)孢率下降

在氮源缺乏的條件下，裂殖酵母從有絲分裂過(guò)程轉(zhuǎn)入減數(shù)分裂過(guò)程，最終產(chǎn)生孢子來(lái)應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺乏的生存環(huán)境。為了檢測(cè)Ash2是否參與裂殖酵母產(chǎn)孢過(guò)程，本研究計(jì)算了野生型細(xì)胞 h90和 h90ash2Δ突變體在缺乏氮源的固體培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢效率。如圖5A所示，野生型h90細(xì)胞的產(chǎn)孢效率為89.1%。ash2+缺失后，產(chǎn)孢效率下降為56.6%，相比于野生型h90降低了 36%。比較了 h90ash2Δ和野生型 h90在缺乏氮源的液體培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢曲線，結(jié)果顯示，相比于野生型 h90，h90ash2Δ細(xì)胞的產(chǎn)孢過(guò)程發(fā)生延遲，最終的產(chǎn)孢率也明顯降低(圖5B)。以上結(jié)果說(shuō)明，Ash2參與了裂殖酵母產(chǎn)孢過(guò)程。

2.5 Ash2參與調(diào)控spk1+編碼區(qū)的H3K4甲基化水

平和spk1+的轉(zhuǎn)錄水平

圖4 Ash2定位在細(xì)胞核內(nèi)并參與H3K4甲基化修飾A：Ash2在細(xì)胞中的定位(標(biāo)尺=10 μm)；B：Western blot檢測(cè)野生型wt、ash2Δ及set1Δ細(xì)胞中H3K4的甲基化水平。

為了驗(yàn)證Ash2是否通過(guò)影響H3K4甲基化參與產(chǎn)孢途徑，本文比較了野生型h90和h90ash2Δ細(xì)胞中MAPK途徑及其下游多個(gè)關(guān)鍵基因的編碼區(qū)H3K4me2水平和轉(zhuǎn)錄水平。這些基因包括spk1+(編碼MAPK)、ste11+(編碼受到Spk1調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子)以及Ste11的靶基因mam2+、map3+和mei2+[21]。ChIP結(jié)果顯示，在氮源缺乏的條件下，相對(duì)于野生型h90細(xì)胞，h90ash2Δ細(xì)胞中的 spk1+編碼區(qū)的 H3K4me2水平顯著下調(diào)(圖6A)。與此相一致的是，定量PCR結(jié)果顯示，h90ash2Δ細(xì)胞中spk1+的mRNA水平明顯下調(diào)(圖6B)。與spk1+的情況不同，h90ash2Δ細(xì)胞中的 ste11+以及 Ste11的靶基因 mei2+、mam2+和map3+編碼區(qū)域的H3K4me2水平?jīng)]有明顯改變(圖6A)，但Ste11的靶基因mei2+、mam2+和map3+轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了明顯下降(圖6B)，這提示Ash2可能通過(guò)調(diào)控spk1+編碼區(qū)的H3K4me2水平，參與spk1+的轉(zhuǎn)錄激活，從而影響下游多個(gè)與產(chǎn)孢相關(guān)基因的表達(dá)。

3 討 論

MAPK途徑是真核生物應(yīng)答外界信號(hào)刺激的的重要途徑，外界的刺激信號(hào)包括生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子和壓力。MAPK途徑參與調(diào)控了細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、神經(jīng)元功能和免疫反應(yīng)等重要的生物學(xué)過(guò)程[22]，該途徑的失調(diào)影響免疫系統(tǒng)和大腦功能從而引起腫瘤和癌癥的發(fā)生[23,24]。因此對(duì)MAPK途徑的調(diào)節(jié)機(jī)制的研究具有重要的臨床價(jià)值。

圖6 ash2+缺失對(duì)于MAPK途徑及其下游關(guān)鍵基因的編碼區(qū)H3K4me2和轉(zhuǎn)錄水平的影響A：ash2+缺失對(duì)于MAPK途徑及其下游關(guān)鍵基因編碼區(qū)的H3K4me2水平的影響。Y軸代表了相對(duì)于fbp1+編碼區(qū)的富集度；野生型h90的數(shù)值設(shè)定為1，h90ash2Δ的數(shù)值為3次生物學(xué)重復(fù)的平均值，并給出了標(biāo)準(zhǔn)差。B：定量PCR分析ash2+缺失對(duì)于MAPK途徑及其下游關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。Y軸代表了相對(duì)于act1+的水平；野生型h90的數(shù)值設(shè)定為1，h90ash2Δ的數(shù)值為3次生物學(xué)重復(fù)的平均值，并給出了標(biāo)準(zhǔn)差。

本研究以COMPASS復(fù)合物亞基Ash2作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)Ash2參與了組蛋白H3K4的甲基化修飾。當(dāng)ash2+缺失時(shí)，H3K4二甲基化水平下降，但并沒(méi)有完全喪失，提示Ash2在二甲基化修飾中發(fā)揮了輔助的作用。ash2Δ細(xì)胞中，H3K4三甲基化修飾幾乎完全喪失，說(shuō)明Ash2在H3K4三甲基化修飾中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。本研究發(fā)現(xiàn)Ash2的缺失會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)孢過(guò)程的延遲，推測(cè)Ash2可能參與了產(chǎn)孢過(guò)程的早期途徑。信息素介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路是產(chǎn)孢早期的關(guān)鍵途徑，它促進(jìn)了細(xì)胞接合，起始減數(shù)分裂。MAPK信號(hào)途徑的缺陷會(huì)中斷產(chǎn)孢過(guò)程，導(dǎo)致產(chǎn)孢效率的急劇下降[25]。本研究檢測(cè)了ash2+缺失時(shí)MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵因子spk1+及下游和ste11+靶基因mei2+、mam2+和 map3+基因編碼區(qū) H3K4二甲基化修飾程度，發(fā)現(xiàn)Ash2通過(guò)影響spk1+編碼區(qū)的H3K4二甲基化水平，參與調(diào)控 spk1+的轉(zhuǎn)錄。與 spk1+的情況不同，ste11+編碼區(qū)的H3K4二甲基化水平和ste11+的轉(zhuǎn)錄水平并沒(méi)有受到ash2+缺失的影響。本文推測(cè)，在ash2Δ細(xì)胞中，由于spk1+轉(zhuǎn)錄水平的降低，引起Spk1的蛋白水平下降，從而影響了Ste11的正常磷酸化。Ste11磷酸化的不足會(huì)引起其活性下降，從而導(dǎo)致了Ste11靶基因，如mei2+、mam2+和map3+的轉(zhuǎn)錄水平的降低。本研究結(jié)果表明Ash2對(duì)于spk1+編碼區(qū)域的H3K4me2的調(diào)控具有特異性，提示可能存在特定的因子將Ash2征集到spk1+的基因座位。在哺乳動(dòng)物中，轉(zhuǎn)錄因子 MEF2D被磷酸化后，招募 Ash2定位于肌肉細(xì)胞分化相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，提高了該區(qū)域的 H3K4甲基化水平，從而促進(jìn)了相關(guān)基因的表達(dá)[26]。在裂殖酵母中，是否采用了相同的形式，由特異性的轉(zhuǎn)錄因子負(fù)責(zé)對(duì)Ash2的征集，還需要更多的后續(xù)研究進(jìn)行驗(yàn)證。

[1] Davey J. Fusion of a fission yeast. Yeast, 1998, 14(16): 1529-1566.

[2] Yang SH, Sharrocks AD, Whitmarsh AJ. MAP kinase signalling cascades andtranscriptional regulation. Gene, 2013, 513(1): 1-13.

[3] Neiman AM, Stevenson BJ, Xu HP, Sprague GF, Herskowitz I, Wigler M, Marcus S. Functional homology of protein kinases required for sexual differentiation in Schizosaccharomyces pombe and Saccharomyces cerevisiae suggests a conserved signal transduction module in eukaryotic organisms. Mol Biol Cell, 1993, 4(1): 107-120.

[4] Iyer SV, Ramakrishnan M, Kasbekar DP. Neurospora crassa fmf-1 encodes the homologue of the Schizosaccharomyces pombe Ste11p regulator of sexual development. J Genet, 2009, 88(1): 33-39.

[5] Sukegawa Y1, Yamashita A, Yamamoto M, Lichten M. The fission yeast stress-responsive MAPK pathway promotes meiosis via the phosphorylation of Pol II CTD in response to environmental and feedback cues. PLoS Genet, 2011, 7(12): e1002387.

[6] Kim L, Hoe KL, Yu YM, Yeon JH, Maeng PJ. The Fission Yeast GATA Factor, Gaf1, Modulates Sexual Development via Direct Down-Regulation of ste11+Expression in Response to Nitrogen Starvation. PLoS ONE, 2012, 7(8): e42409.

[7] Ozoe F, Kurokawa R, Kobayashi Y, Jeong HT, Tanaka K, Sen K, Nakagawa T, Matsuda H, Kawamukai M. The 14-3-3 proteins Rad24 and Rad25 negatively regulate Byr2 by affecting its localization in Schizosaccharomyces pombe. MolCell Biol, 2002, 22(20): 7105-7119.

[8] Roguev A, Shevchenko A, Schaft D, Thomas H, Stewart AF, Shevchenko A. A comparative analysis of an orthologous proteomic environment in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Mol CellProteomics, 2004, 3(2): 125-132.

[9] Dehé PM, Dichtl B, Schaft D, Roguev A, Pamblanco M, Lebrun R, Rodríguez-Gil A, Mkandawire M, Landsberg K, Shevchenko A, Shevchenko A, Rosaleny LE, Tordera V, Chávez S, Stewart AF, Geli V. Protein interactions withinthe Set1 complex and their roles in the regulation of histone 3 lysine 4 methylation. JBiol Chem, 2006, 281(46): 35404-35412.

[10] Zentner GE, Henikoff S. Regulation of nucleosome dynamics by histone modifications. Nat Struct Mol Biol, 2013, 20(3): 259-266.

[11] Kim T, Buratowski S. Dimethylation of H3K4 by Set1 recruits the Set3 histone deacetylase complex to 5' transcribed regions. Cell, 2009, 137(2): 259-272.

[12] Lee JH, Tate CM, You JS, Skalnik DG. Identification and characterization of the human Set1B histone H3-Lys4 methyltransferase complex. JBiol Chem, 2007, 282(18): 13419-13428.

[13] Sollier J, Lin W, Soustelle C, Suhre K, Nicolas A, Géli V, de La Roche Saint-André C. Set1 is required for meiotic S-phase onset, double-strand break formation and middle gene expression. EMBO J, 2004, 23(9): 1957-1967.

[14] Acquaviva L, Drogat J, Dehé PM, de La Roche Saint-André C, Géli V. Spp1 at the crossroads of H3K4me3 regulation and meiotic recombination. Epigenetics, 2013, 8(4): 355-360.

[15] Pérez-Lluch S, Blanco E, Carbonell A, Raha D, Snyder M, Serras F, Corominas M. Genome-wide chromatin occupancy analysis reveals a role for ASH2 in transcriptional pausing. Nucleic Acids Res, 2011, 39(11): 4628-4639.

[16] Cheng MK, Shearn A. The direct interaction between ASH2, a Drosophila trithorax group protein, and SKTL, a nuclear phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase, implies a role for phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate in maintaining transcriptionally active chromatin. Genetics, 2004, 167(3): 1213-1223.

[17] Stoller JZ, Huang L, Tan CC, Huang F, Zhou DD, Yang J, Gelb BD, Epstein JA. Ash2l interacts with Tbx1 and is required during early embryogenesis. Exp Biol Med, 2010, 235(5): 569-576.

[18] Forsburg SL, Rhind N. Basic methods for fission yeast. Yeast, 2006, 23(3): 173-183.

[19] Alfa C, Fantes P, Hyams J, McLeod M, Warbrick E. Experiments with fission yeast: a laboratory course manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993.

[20] Kawakami K, Hayashi A, Nakayama J, Murakami Y. A novel RNAi protein, Dsh1, assembles RNAi machinery on chromatin to amplify heterochromatic siRNA. Genes Dev, 2012, 26(16): 1811-1824.

[21] Mata J, B?hler J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(42): 15517-15522.

[22] Krishna M, Narang H. The complexity of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) made simple. Cell MolLife S, 2008, 65(22): 3525-3544.

[23] Gerits N, Kostenko S, Moens U. In vivo functions of mitogen-activated protein kinases: conclusions from knock-in and knock-out mice. Transgenic Res, 2007, 16(3): 281-314.

[24] Wagner EF, Nebreda áR. Signal integration by JNK and p38 MAPK pathways in cancer development. Nat Rev Cancer, 2009, 9(8): 537-549.

[25] Kjaerulff S, Lautrup-Larsen I, Truelsen S, Pedersen M, Nielsen O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol, 2005, 25(5): 2045-2059.

[26] Rampalli S, Li L, Mak E, Ge K, Brand M, Tapscott SJ, Dilworth FJ. p38 MAPK signaling regulates recruitment of Ash2L-containing methyltransferase complexes to specific genes during differentiation. Nat Struct Mol Biol, 2007, 14(12): 1150-1156.

(責(zé)任編委: 何 群)

Ash2, a subunit of histone H3K4 methyltransferase complex, is involved in the sporulation in Schizosaccharomyces pombe

Wenchao Wang1,2, Huan Zhou1,2, Yao Yu1,2, Hong Lv1,2

1. State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Shanghai 200433, China
2. Shanghai Engineering Research Center of Industrial Microorganisms Fudan University, Shanghai 200433, China

Schizosaccharomyces pombe undergoes meiosis instead of mitosis under conditions of nitrogen starvation and pheromone signalling, which results in conjugation and sporulation. During this progress, the pheromone-responsive MAPK(Mitogen-activated protein kinases) pathway plays an important role in regulating the conjuation and the transcriptionalactivation of genes required for meiosis. Spk1, a key component of MAPK pathway, activates Ste11 through protein phosphorylation and then induced the transcriptions of several genes requied for meiosis, including mei2+, mam2+and map3+. Methylation of histone H3K4 is involved in several important biological processes, including transcriptional activation and chromatin remodeling. However, its role in the sporualtion of fission yeast is poorly understood. Ash2 is a subunit of COMPASS, a conserved H3K4 methyltransferase complex. Sequence alignment analysis revealed that Ash2 in pombe shares two conserved domain with other homologues. Ash2 is localized in nucleus and contributes to methylation of H3K4. Deletion of ash2+resulted in a delay of sporulation and a substantial drop of sporulation efficiency. ChIP and qPCR analysis showed that deletion of ash2+caused a reduction of H3K4me2 level in the coding region of spk1+, as well as a reduction of its mRNA level. Although the mRNA level of ste11+kept unchanged, the levels of Ste11-targetted genes, such as mei2+, mam2+and map3+, all reduced in ash2Δ cells. The results suggest that Ash2 regulates MAPK pathway and sporulation through H3K4 methylation. This might provide a new clue to elucidate the link between meiosis and epigenetic regulation.

Schizosaccharomyces pombe; H3K4 methylation; Ash2; sporulation;MAPK

2014-04-01;

2014-04-15

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(編號(hào)：2009CB825601)，國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31200961)，高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(編號(hào)：20120071120010)和上海市科委基地建設(shè)項(xiàng)目(編號(hào)：13DZ2252000)資助

王文超，碩士研究生，專業(yè)方向：微生物分子遺傳學(xué)。E-mail：11210700068@fudan.edu.cn

呂紅，博士，教授，研究方向：微生物遺傳學(xué)。E-mail：honglv@fudan.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0943

時(shí)間: 2014-7-18 11:32:12

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140718.1132.002.html