張文平，張貴華，柯 瑾，馬云淑

（云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

馬錢子又名苦實、番木鱉、馬錢子等，味苦、性寒，有大毒，為馬錢子科馬錢子屬植物馬錢子（Strychnos nux-vomica）或云南馬錢（Strychnos pierriana）的干燥成熟種子，具有改善微循環(huán)，增加血流、抑制腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌作用[1]?？捎糜谥委熌X血管病后偏癱及面癱、癌癥疼痛、坐骨神經(jīng)痛、頸椎病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[2]。馬錢子的藥理和臨床應(yīng)用價值非常突出，馬錢子堿和士的寧是主要藥效成分，并能相互促進(jìn)吸收[3]。為了對馬錢子主要有效成分的透皮給藥制劑及其他制劑提供馬錢子提取物，本實驗采用回流提取法，以士的寧與馬錢子堿總量為指標(biāo)，采用正交試驗法優(yōu)選其最佳提取工藝，為以后進(jìn)一步研究提供科學(xué)合理的現(xiàn)代制劑實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1100）；TYS-100型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司）；T-1000型電子天平（常熟雙杰測試儀器廠）；DZF型真空干燥箱（北京永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試藥

馬錢子原藥材（購自菊花村中藥材市場，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室楊樹德教授鑒定為馬錢科植物馬錢Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟種子）；士的寧對照品（購自中國生物制品檢定所，批號：110705-200306）；馬錢子堿對照品（購自中國生物制品檢定所，批號：110706-200505）。無水乙醇、硫酸、鹽酸、磷酸等為分析純，乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品測定方法

2.1.1 色譜條件

采用高效液相色譜法，色譜柱為LicrospherC18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相為乙腈-0.01mol/L庚烷磺酸鈉與0.02mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液（23：77），10%磷酸調(diào) pH 值為 2.8；流速為 1mL/min；檢測波長：260nm，進(jìn)樣量 10μL；柱溫：30℃。

2.1.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取士的寧堿對照品6mg、馬錢子堿對照品5mg，分別置于10mL容量瓶中，加三氯甲烷適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取2mL，置同一10mL中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（士的寧0.12mg/mL、馬錢子堿0.10mg/mL）。

2.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取生馬錢子粗粉（過2號篩，下同）10.000g置于250mL圓底燒瓶中，按照正交試驗表加熱回流提取3次，抽濾，合并提取液。分別用各自濃度乙醇定容至250mL容量瓶中搖勻，密取吸取1mL提取液用各自濃度的乙醇定容至10mL容量瓶中，離心10min，頻率（5000r/min），取上清液過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對照品溶液 1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0μL注入高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程，馬錢子堿標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1491.386x+20.75，r=0.9998；士的寧標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1873x+8.041，r=0.9999。結(jié)果表明馬錢子堿進(jìn)樣量在0.1～1.0μg；士的寧進(jìn)樣量在0.125～1.2μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 含量測定

分別精密吸取對照品與供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，測定士的寧與馬錢子堿峰面積，計算含量。

2.2 提取工藝設(shè)計

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 提取溶劑的選擇[4-5]

精密稱取馬錢子粉8份10g，分別加8倍量下列溶劑（蒸餾水、0.5mol/L硫酸、1mol/L鹽酸、1mol/L硝酸、1%硝酸、50%乙醇、堿性氯仿（加氫氧化鈉試液混勻），浸泡30min，第一次回流提取2h，第二次1h，第三次0.5h，每次提取液均要分別收集，最后分別合并并稀釋定容到250mL，按2.1.5項下方法測定，實驗結(jié)果見表1。

表1 不同溶劑馬錢子堿和士的寧提取量

氯仿毒性大，而硝酸破壞馬錢子生物堿成分，酸水溶出雜質(zhì)多，通過比較馬錢子堿和士的寧的提取率大小，綜合各種因素，最終選擇50%乙醇最為最佳溶劑。

2.2.1.2 溶劑pH的考察

取馬錢子粉12份，每份10g，分別加鹽酸和氫氧化鈉調(diào) pH=3，5，7，9 的 50%乙醇 80mL，浸泡30min，回流提取3次，每次1h，將提取液抽濾并收集濾液，合并每次濾液定容到250mL，精密取1mL至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，3000r/min離心10min，取上清液用0.45μm的微孔濾膜過濾并裝入進(jìn)樣瓶中，參照2.1.5項下含量測定方法，精密吸取10μL，HPLC測定士的寧與馬錢子堿總量。結(jié)果表明，pH在5~7之間為宜。實驗結(jié)果見表2。

表2 不同PH馬錢子堿和士的寧提取量

2.2.2 正交試驗設(shè)計

2.2.2.1 因素水平的確定與考察指標(biāo)[6]

以50%乙醇為溶劑，選取乙醇濃度A、乙醇用量B、回流時間C為考察因素，以士的寧與馬錢子堿總含量為指標(biāo)，采用L9（34）正交表安排試驗。提取工藝優(yōu)選因素水平表見表3。

表3 提取工藝因素水平表

2.2.2.2 正交試驗結(jié)果及方差分析

精密稱取生馬錢子粗粉（過2號篩，混勻）27份（每號實驗平行3次），每份約10g，置于250mL圓底燒瓶中，加熱回流提取3次，抽濾，合并提取液。分別用不同濃度乙醇定容至250mL容量瓶中搖勻，密取吸取1mL提取液用相應(yīng)濃度的乙醇定容至10mL容量瓶中，搖勻，3000r/min離心10min，取上清液，按2.1.5項下含量測定方法測定含量，結(jié)果見表4，方差分析見表5。

通過正交試驗直觀分析，方差分析表可知，各因素影響順序為A>C>B，其中乙醇濃度對士的寧與馬錢子堿的提取結(jié)果影響最大，理論最佳提取工藝條件為A1B3C3，即加50%乙醇提取3次，加醇量為10倍量，每次2h。

表4 L9（34）正交實驗設(shè)計及結(jié)果

表5 方差分析表

2.2.3 提取工藝驗證性試驗

平行稱取藥材粗粉3份，每份10g，精密稱定，按優(yōu)選出的工藝進(jìn)行重復(fù)性驗證試驗，結(jié)果見表6。結(jié)果表明正交試驗優(yōu)選的工藝條件較好，說明此工藝合理可行。

3 討論

生馬錢子為苦寒大毒之品，臨床醫(yī)生多畏之，即使用者也以外用居多。而鑒于其外用的療效確切，劑量小，治療藥效強(qiáng)，工業(yè)化生產(chǎn)更顯得重要，本實驗為工業(yè)化大生產(chǎn)提供了科學(xué)合理可行的實驗依據(jù)。

馬錢子粉用50%乙醇浸泡30min后按篩選出的工藝提取，馬錢子總堿提取率比不浸泡高。

表6 驗證試驗結(jié)果

目前對馬錢子中士的寧與馬錢子堿總量的提取方法的報道較少，以回流提取法提取率較高，而報道有用65%乙醇10倍量、回流3次，每次1h的提取方法，但其也僅僅以士的寧提取率為指標(biāo)，考察不夠全面，且優(yōu)選對象為制馬錢子，綜上考慮，本實驗用50%乙醇為溶媒，以馬錢子堿和士的寧2種主要成分的轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)對生品馬錢子的醇提工藝進(jìn)行全面正交優(yōu)選，最佳工藝結(jié)果表明兩生物堿的提取率較高，證明該工藝合理。

本實驗參照2010版藥典（一部）方法直接測定提取液中馬錢子堿和士的寧的含量，簡單可行，省去了后續(xù)萃取純化過程，減少生物堿成分損失。

[1]旭坤，蔡寶昌.Brucine對Heps荷瘤小鼠的抗腫瘤作用和毒性的研究[J].中國藥理學(xué)通報，2006，22（1）：35-39.

[2]焦楊.馬錢子的研究進(jìn)展 [J].醫(yī)學(xué)理論與實踐，2009，22（8）：918-919.

[3]朱建偉，武繼彪.李成韶，等.馬錢子堿鎮(zhèn)痛作用及其藥效動力學(xué)研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2005，12（3）：166.

[4]湯淮波，張令君，李湘玲，等.不同溶劑提取馬錢子中士的寧與馬錢子堿的實驗研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，15（11）：52-53.

[5]祁艷，陳軍.馬錢子總生物堿提取純化工藝及抗腫瘤研究[J].中成藥，2010，32（3）：405-408.

[6]王利杰，蔡寶昌，陳軍，等.生馬錢子醇提工藝正交設(shè)計優(yōu)選[J].中成藥，2009，31（4）：629-631.