郭 珍 陳復(fù)生 李潤(rùn)潔

(河南工業(yè)大學(xué)，鄭州 450001)

花生是我國(guó)主要的油料資源，同時(shí)富含24%～36%的蛋白質(zhì)。花生蛋白含有多種必需氨基酸，不含膽固醇［1］。與大豆蛋白相比，抗?fàn)I養(yǎng)因子較少，可消化性強(qiáng)。目前我國(guó)利用花生制油過程造成了花生蛋白的損失與變性，因此，探尋一種新型制備花生蛋白技術(shù)有著重要的意義。

反膠束萃取技術(shù)是一種新型的可用于提取具有生物活性物質(zhì)的技術(shù)［2］。已有研究顯示，反膠束萃取技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)大豆中蛋白質(zhì)和油脂同時(shí)分離，并減少蛋白質(zhì)的變性，且大多數(shù)采用的都是AOT單一反膠束體系，而研究發(fā)現(xiàn)，把不同類型表面活性劑混合起來制備可以形成具有良好性質(zhì)的混合反膠束體系，增加增溶水量［3－4］，因此本試驗(yàn)將陰離子表面活性劑AOT與SDS混合配制復(fù)合反膠束進(jìn)行研究。

本試驗(yàn)采用AOT－SDS/異辛烷－正辛醇復(fù)合反膠束對(duì)花生蛋白進(jìn)行提取，考察pH、時(shí)間、KCl、溫度對(duì)后萃率的影響，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，以后萃率為指標(biāo)獲取較佳工藝條件，為反膠束在花生蛋白提取過程中的應(yīng)用獲得數(shù)據(jù)指導(dǎo)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)原料

全脂花生粉:河南帝鑫食品有限公司。

1.2 主要試劑

丁二酸二異辛酯磺酸鈉(AOT):上海海曲化工廠;十二烷基硫酸鈉(SDS):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;異辛烷、正辛醇，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，氯化鉀均為分析純。

1.3 試驗(yàn)儀器

BS210S型電子天平:德國(guó)Sartorius公司;GL–20L型高速冷凍離心機(jī)、ZSD–2J型自動(dòng)水分滴定儀:上海安亭電子儀器廠;pH 211型酸度計(jì):意大利HANNA公司;Nichipet EXII型移液槍:日本Nichiryo公司;UV－1901型紫外分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;KQ－250B型超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作［5］

以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白液在280 nm處吸光值，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 280 nm處牛血清白蛋白濃度與吸光值的關(guān)系

2.2 AOT/SDS 反膠束溶液配制［6］

稱取1.6 g AOT與1.2 g SDS表面活性劑置于100 mL錐形緩沖溶液瓶中，同時(shí)加入32 mL異辛烷，3 mL正辛醇和適量pH為8的KH2PO4－K2HPO4緩沖溶液，磁力攪拌使之混合均勻，再超聲處理一定時(shí)間至溶液透明。

2.3 蛋白質(zhì)前萃液的配制

按0.01 g/mL將全脂花生粉加入配制好的反膠束溶液中，在35℃條件下超聲15 min，超聲功率為210 W，然后以3 000 r/min的速度離心15 min，取上清液(即前萃液)，采用紫外分光光度法在280 nm處測(cè)其吸光值。

2.4 蛋白質(zhì)后萃液的配制及后萃率的計(jì)算

取一定體積的前萃液與等體積的一定濃度一定pH的KCl的KH2PO4－K2HPO4緩沖液混合，超聲處理一定時(shí)間后在4 000 r/min條件下離心15 min，取下層水相(后萃液)在280nm處測(cè)其吸光值。

蛋白質(zhì)后萃率=后萃液中蛋白質(zhì)量(g)/前萃液中蛋白質(zhì)量(g)×100%

2.5 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取pH、時(shí)間、KCl、溫度4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。主要以蛋白質(zhì)后萃率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的方法優(yōu)化花生蛋白的提取工藝參數(shù)，結(jié)合DPS v7.05軟件進(jìn)行分析，試驗(yàn)因素、水平及編碼見表1。

表1 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)因素水平編碼表

3 結(jié)果與討論

3.1 四因素二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果

采用四因素二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，研究pH、溫度、時(shí)間、KCl濃度對(duì)后萃率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

表2(續(xù))

3.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

利用DPS軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸方差分析，分析結(jié)果見表3，得到的二次回歸模型為:Y=73.039 49+10.472 14A+0.791 24B+6.589 34C+0.716 203D －1.693 95A2－0.666 15B2－3.064 35C2－0.568 26D2－0.893 21AB －8.171 01AC －0.193 32AD －2.410 43BC －2.655 15BD+1.617 56CD，在 α =0.10顯著水平剔除不顯著項(xiàng)后，簡(jiǎn)化后的回歸方程:Y=73.039 49+10.472 14A+6.589 34C －3.064 35C2－8.171 01AC。

由表3可知，回歸方程失擬檢驗(yàn) F1=1.323＜F0.05(10，6)=4.06，說明未控制因素對(duì)試驗(yàn)影響很小，可進(jìn)一步對(duì)回歸模型進(jìn)行擬合檢驗(yàn);擬合檢驗(yàn)F2=4.984 ＞ F0.05(14，16)=2.35，說明回歸模型達(dá)到顯著水平，方程與實(shí)際情況擬合良好，能夠較好的反映pH、時(shí)間、KCl濃度、溫度與后萃率的關(guān)系。單因素中，pH(A)以及KCl濃度(C)對(duì)萃取率的影響極顯著，交互項(xiàng)AC(溫度和KCl濃度)達(dá)到了極顯著水平。由殘差分析圖2也可以看出，實(shí)際觀測(cè)值與回歸擬合值之差落在－3～3范圍內(nèi)，說明回歸模型良好。

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

圖2 殘差分析圖

3.3 主因子效應(yīng)分析

從所建立的回歸方程的偏回歸系數(shù)絕對(duì)值的大小可判明因子的重要程度，系數(shù)的正負(fù)表示因子效應(yīng)作用的方向［7］。因此，各因素在試驗(yàn)取值范圍內(nèi)對(duì)蛋白質(zhì)后萃率作用大小依次為:pH(A)＞KCl濃度(C)＞溫度(B)＞時(shí)間(D)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響都是正效應(yīng)。

3.4 單因素效應(yīng)分析

將4個(gè)因素中3個(gè)因素固定在零水平，對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析，得到以另一個(gè)因素為決策變量的偏回歸模型，分析結(jié)果見表4及圖2。

表4 單因素效應(yīng)分析

圖3 單因素與后萃率的關(guān)系

由表4及圖3可以看出，隨著時(shí)間(B)以及溫度(D)的升高，蛋白質(zhì)的后萃率幾乎沒有變化，即時(shí)間與溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，而pH(A)以及KCl濃度(C)的變化會(huì)引起后萃率顯著的變化。

在pH為5～9范圍內(nèi)(試驗(yàn)水平為－2～2)，隨著pH的升高，后萃率逐漸上升。后萃過程相當(dāng)于水萃取過程，與蛋白質(zhì)在水中的溶解度有關(guān)。AOT與SDS都是陰離子表面活性劑，極性頭朝內(nèi)使反膠束內(nèi)層帶負(fù)電荷，隨著pH逐漸升高，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷的密度逐漸增加，與反膠束之間的靜電斥力逐漸增大，使溶進(jìn)“水池”中的蛋白質(zhì)逐漸反向萃取到水相中，后萃率逐漸增大。

在離子濃度為0～2 mol/L范圍內(nèi)(試驗(yàn)水平為－2～2)，隨著離子濃度的升高，后萃率先升高后降低。當(dāng)離子濃度升高時(shí)，反膠束內(nèi)表面的雙電子層變薄，一方面減弱了表面活性劑極性頭之間的排斥作用，使反膠束尺寸變小，迫使蛋白質(zhì)溶出，另一方面又使靜電引力減小，蛋白質(zhì)在“水池”中的溶解度下降，但當(dāng)離子濃度過高，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析作用，有可能引起蛋白質(zhì)的變性從而與表面活性劑發(fā)生聚集，使得后萃率降低。離子濃度過高也給后續(xù)蛋白質(zhì)的精制帶來困難［8］。

3.5 試驗(yàn)因子間交互效應(yīng)分析

根據(jù)表3中對(duì)數(shù)學(xué)模型的方差分析可知，交互項(xiàng)偏回歸系數(shù)AC項(xiàng)達(dá)到了極顯著的水平，其余均未達(dá)到顯著水平，因此只對(duì)溫度和KCl濃度之間的交互作用進(jìn)行討論。對(duì)其作圖見圖4。

由圖4可以看出，當(dāng)pH處于較低水平時(shí)，隨著KCl濃度的升高后萃率逐漸升高，當(dāng)pH處于零水平時(shí)，隨著KCl濃度的升高后萃率先升高后降低，當(dāng)pH處于較高水平時(shí)，隨著KCl濃度的升高后萃率逐漸下降，pH與KCl濃度同時(shí)取較高或同時(shí)取較低都會(huì)產(chǎn)生一個(gè)較低的后萃率。

圖4 KCl濃度與pH對(duì)后萃率影響的響應(yīng)面圖

3.6 工藝優(yōu)化及驗(yàn)證

由于試驗(yàn)過程中，不僅單因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響，而且還存在著交互作用，因此很難找出最優(yōu)條件，同時(shí)由于四元二次方程不存在極值問題，因此也無法從回歸模型中得到最佳配比?？紤]到不同因素對(duì)花生蛋白的影響作用，采用頻率分析的方法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，后萃率大于68.40%的375個(gè)方案中，各變量取值的頻率分布見表5。

表5 各變量取值的頻率分布表

由表5可知，在95%的置信區(qū)間優(yōu)化方案為:pH為 7.263 ～7.537，時(shí)間為 28.57 ～31.43 min，KCl濃度1.101 ～1.232 5 mol/L，溫度34.285 ～35.715 ℃?？紤]到實(shí)際可操作性，將方案調(diào)整為:pH 7.5，時(shí)間30 min，KCl濃度 1.1 mol/L，溫度35 ℃。對(duì)此方案進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，平行試驗(yàn)3次，得到后萃率平均值為79.03%，與優(yōu)化試驗(yàn)的理論值78.65%比較接近。

4 結(jié)論

4.1 采用AOT－SDS/異辛烷－正辛醇復(fù)合反膠束體系實(shí)現(xiàn)了對(duì)花生蛋白的后萃，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了工藝的優(yōu)化，得到二次回歸模型:Y=73.039 49+10.472 14A+6.589 34C －3.064 35C2－8.171 01AC。對(duì)回歸模型分析可知，pH和KCl以及二者的交互作用對(duì)結(jié)果影響顯著，時(shí)間以及溫度影響不顯著。

4.2 通過頻率分析以及統(tǒng)計(jì)尋優(yōu)得到在95%置信區(qū)間后萃率大于67.5%的優(yōu)化方案為pH為7.263～7.537，時(shí)間 28.57 ～ 31.43 min，KCl濃度 1.101 ～1.233 mol/L，溫度34.285 ～35.715 ℃。為貼近實(shí)際操作將方案調(diào)整為 pH 7.5，時(shí)間 30 min，KCl濃度1.1 mol/L，溫度35 ℃，后萃率達(dá)79.03%，與理論值78.65%比較接近。

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