田偉君,王勇梅,孫會梅,趙陽國,2,白 潔,2,吳承林 (.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島26600；2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 26600)

河口濕地是陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)之間重要的過渡帶,由陸源產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)和有機(jī)有毒性物質(zhì)在通過河口濕地進(jìn)入海洋時(shí)經(jīng)歷了生物、地質(zhì)及水文等因子的共同作用,經(jīng)過各種物理、化學(xué)過程得到凈化.無論是對地表水和海水,它都起到一定的滯留作用,是保護(hù)海洋生態(tài)系統(tǒng)免受來自陸源污染的最后一道屏障[1-2].但作為陸海相互作用的集中地帶,河口濕地生態(tài)系統(tǒng)也相對敏感脆弱.近年來,外源污染物不斷輸入,對濕地生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定已經(jīng)形成潛在危害.尤其是我國河口濕地分布著許多大型油田(如遼河油田,勝利油田等),油田開發(fā)強(qiáng)度大、井噴油管破裂、原油泄漏、油井鉆探等使河口濕地普遍存在不同程度的石油污染,嚴(yán)重威脅到濕地生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展[3].

土壤微生物群落是濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,在濕地凈污過程中發(fā)揮重要的作用[4-6].絕大多數(shù)有機(jī)物的降解、氮磷硫物質(zhì)的生物地球化學(xué)循環(huán)等都是微生物在群落水平,通過各種單一功能的種群依次梯級作用實(shí)現(xiàn)的[7-8],某種或某類微生物的數(shù)量或活性的消長都會直接影響到群落功能的完成,最終導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)的失衡甚至破壞.因此,已有一些學(xué)者研究石油污染物的輸入對微生物群落的影響,但主要是分析石油污染物對農(nóng)業(yè)、林地和草地土壤及植物根際微生物群落的影響[9-16],而對河口濕地微生物群落影響的研究則較少,主要原因一方面是輸入河口濕地的污染物種類繁多,模擬分析設(shè)備環(huán)境條件控制困難,且在短時(shí)間內(nèi)揭示漫長的污染馴化過程難度很高;另一方面受傳統(tǒng)微生物分析方法的限制.因此,本文以遼東灣雙臺子河河口濕地為對象,針對該地區(qū)油井密布的實(shí)際情況,以石油污染物為主要污染物,采用濕地模擬實(shí)驗(yàn)裝置,通過常規(guī)監(jiān)測和PCR-DGGE技術(shù)分析微生物群落長期暴露于污染物中時(shí)逐漸演替、更疊的真實(shí)情況,為開發(fā)其中的微生物資源和保護(hù)河口濕地提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 濕地模擬及實(shí)驗(yàn)用水

針對雙臺子河河口濕地進(jìn)水的實(shí)際情況,結(jié)合濕地土壤及濕地植物根系的生長狀況,利用PVC及有機(jī)玻璃等材料研制6組帶配水裝置(以滿足模擬濕地進(jìn)水的可控性)的濕地模擬試驗(yàn)成套裝置,將高約 50cm 的雙臺河河口濕地土壤及濕地植物原位移入濕地模擬裝置.

表1 采樣條件及實(shí)驗(yàn)用水情況Table 1 Characterization of river water for drip-irrigation and diesel oils addition

根據(jù)蘆葦濕地實(shí)際進(jìn)水調(diào)查結(jié)果,蘆葦濕地主要進(jìn)水分別為每年的5月初和6月底,其余時(shí)間均為適量補(bǔ)水.因此,分別于 2011年 5月和 6月采集主要進(jìn)水河流和引水泵站的水樣,測定的石油類污染物濃度為 0.27～1.3mg/L.提水站水樣中石油類污染物的濃度明顯高于河流中的,說明柴油提水泵的使用增加了水中石油類的濃度,由于蘆葦濕地用水主要依賴提水泵站的供應(yīng),因此本研究實(shí)驗(yàn)用水用柴油與河水進(jìn)行配水,且實(shí)驗(yàn)期間保持進(jìn)水中石油類污染物濃度為1.3 mg/L.具體實(shí)驗(yàn)期實(shí)驗(yàn)用油量及環(huán)境條件如表1所示.

1.2 樣品采集與處理

采用抖根法分別取對照組和實(shí)驗(yàn)組-10,-20,-30,-40cm 處蘆葦根際土壤樣品,用無菌封口袋裝好帶回實(shí)驗(yàn)室,土壤首先通過孔徑 2mm 篩,去除較大植物組織與石塊,然后在冰上手工剔除肉眼可見的細(xì)根.土樣分成3份,第1份保存在4℃用于土壤環(huán)境參數(shù)和種群數(shù)量計(jì)數(shù),第 2份保存在-20℃用于變性梯度凝膠電泳(DGGE )研究,第3份低溫避光條件下自然風(fēng)干,粉碎研磨后過100目篩,用于正構(gòu)烷烴和多環(huán)芳烴分析.所有樣品處理在取樣后6h內(nèi)完成.

1.3 正構(gòu)烷烴和多環(huán)芳烴的測定

稱 10.0g土壤樣品,加入少量無水硫酸鈉后用濾紙包好放入索氏抽提器中,瓶底放2.0g銅片去除硫的干擾,加入回收率指示物.150mL正己烷/二氯甲烷(V:V/1:1)索氏提取 24h(水浴鍋溫度80℃).將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至 5mL,加入 5mL正己烷再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至 5mL.濃縮液過氧化鋁(3cm)、硅膠(6cm)和無水硫酸鈉(0.5 cm)層析柱,分別用正己烷、二氯甲烷/正己烷(V:V/3:7)混合液洗脫樣品得到正構(gòu)烷烴、多環(huán)芳烴.最后將淋洗液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1mL轉(zhuǎn)移至2mL棕色進(jìn)樣瓶中,用柔和的氮?dú)獯抵两?然后用正己烷定容至1mL,待上機(jī)測定.

采用Agilent氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀HP6890 GC-HP5975MSD對樣品中的烷烴和多環(huán)芳烴進(jìn)行分析.對樣品的定性分析主要依據(jù)其特征離子和色譜保留時(shí)間,同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜圖和質(zhì)譜庫內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行對照.烷烴和多環(huán)芳烴定量采用外標(biāo)法.

1.4 土壤微生物種群數(shù)量測定方法

細(xì)菌、放線菌、真菌數(shù)量采用稀釋平板法計(jì)數(shù),其所用培養(yǎng)基分別為:細(xì)菌－牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏 3.0g,蛋白胨 10.0g,NaCl 5.0g,瓊脂18.0g蒸餾水 1000mL,pH7.4～7.6);放線菌－高氏一號培養(yǎng)基(可溶性淀粉20.0g, NaCl 0.5g, KNO31.0g,H2O 0.5g, M0.5g,7H2O 0.01g,瓊脂 18.0g,水 1000mL, pH7.4～7.6);真菌－鏈霉素-馬丁孟加拉紅培養(yǎng)基(蛋白胨 5g,葡萄糖 10.0g, KH2PO41.0g, MgSO4·7H2O 0.5g,瓊脂 18.0g,1/3000孟加拉紅溶液 100mL,蒸餾水1000mL,鏈霉素0.03g,pH 7.4～7.6).

石油降解菌數(shù)量測定采用最大或然數(shù)(MPN)法測定[17-18],所用的培養(yǎng)基為改良的 Bushnel-Haas 培 養(yǎng) 基 (MgSO4·7H2O 0.2g,CaCl20.02g,KH2PO41.0g,(NH4)2HPO4,1.0g KNO31.0g,FeCl30.05g,柴油1.0mL,蒸餾水1000mL,pH7.6～7.8).

1.5 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析

1.5.1 DNA的提取 所有土壤樣品DNA的提取均采用PowerSoil DNA Isolation Kit (MOBIO Laboratories)試劑盒,稱取0.25g土壤樣品,按試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行土壤微生物總DNA提取.在1%瓊脂糖(1×TAE緩沖液)凝膠(內(nèi)含5%的EB染料)中對提取的DNA進(jìn)行檢測.

1.5.2 PCR 擴(kuò)增 所用引物為細(xì)菌 16S rDNA V3區(qū)通用引物,F341和BA534-GC[19].擴(kuò)增反應(yīng)體系為 40μL 體系:包括 10×PCR buffer 4μL;dNTP(2.5mmol/μL) 3.2μL;每種引物 1.2μL;模板2μL;Taq DNA聚合酶0.4μL;加ddH2O至終體積40μL.反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性 94℃ 5min 30 個(gè)循環(huán)包括 94℃變性 40s,50℃退火 30s,72℃延伸 90s,最后 72℃延伸 10min.PCR完成后取反應(yīng)產(chǎn)物5μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并與定量Maker DL 2000進(jìn)行對比.

1.5.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析 采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進(jìn)DGGE分析[20].制備8%的丙烯酰胺溶液(丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的比例為37.5:1),使用梯度混合裝置,制備 8%聚丙烯酰胺梯度凝膠,變性劑尿素和甲酞胺的濃度從 30%到60%,變性劑濃度從膠的上方到下方遞增.促凝膠催化劑TEMED和過硫酸氨(APS)的終濃度分別為 0.09%(V/V)和 0.05%(V/V).將凝固后的膠板放入加有 l×TAE緩沖液的電泳槽中,取 PCR產(chǎn)物20μL 和 4μL 6×Loading Buffer混合后加入上樣孔中,60℃,150V 電泳 9h.電泳結(jié)束后,將凝膠用EB (l:1000的稀釋液)進(jìn)行染色 30min,然后去離子水浸洗 2min.染色之后,在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察凝膠的條帶,并拍攝圖像.

1.5.4 DGGE條帶的切割、克隆與測序 切割亮度較明顯的條帶,編號放入1.5mL滅菌的離心管中,并加入20μL滅菌水磨碎,用引物F341和BA534R重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)生長度為200bp的片段,其他步驟同上述 PCR擴(kuò)增.電泳切取亮帶放入收集管中待純化.產(chǎn)物純化按spin膠純化試劑盒說明書進(jìn)行.將已純化的 PCR產(chǎn)物連接到載體 PMD19-T Vector上,導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 加入LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng).以M13為引物進(jìn)行菌落PCR,檢測產(chǎn)物是否為陽性.測序由南京金斯瑞公司執(zhí)行.

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及相關(guān)性分析采用SPSS 19.0.測序后其結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行檢索并進(jìn)行同源性比較.15條優(yōu)勢帶的基因片段序列與GenBank中細(xì)菌序列相似性分析,其測序結(jié)果可以確定出各條帶所代表的菌群分類地位.應(yīng)用QuantityOne軟件對DGGE圖譜中的條帶數(shù)目和亮度進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 正構(gòu)烷烴和多環(huán)芳烴在蘆葦根際的分布

蘆葦根區(qū)土壤中正構(gòu)烷烴各組分的濃度及分布情況見圖 1.濕地蘆葦根區(qū)土壤中定量檢出的正構(gòu)烷烴系列主要集中在C10～C33之間.含油河水灌溉的實(shí)驗(yàn)組蘆葦根區(qū)土壤正構(gòu)烷烴的分布與對照組明顯不同,實(shí)驗(yàn)組濃度較高且主要集中在C13～C26之間,其中C20左右的濃度最高,達(dá)到了 3.33μg/g.而對照組各碳數(shù)的分布較為平均且濃度均較低,最高值僅為 0.052μg/g,近于實(shí)驗(yàn)組的百分之一.從蘆葦整個(gè)生長期來看,實(shí)驗(yàn)組各月份正構(gòu)烷烴的分布特征較為相似,均為單峰型分布,顯示了石油烴的輸入特征[21].從縱向看,對照組-10cm 處正構(gòu)烷烴總濃度(∑n-alkanes)為0.313～0.395μg/g,-40cm 處∑n-alkanes 濃度為0.233～0.292μg/g,在縱向上基本符合-10cm>-20cm>-30cm>-40cm,但隨土層深度的變化幅度較小,分布較為均勻;實(shí)驗(yàn)組-10cm 處∑n-alkanes濃度在 23.69～34.84μg/g之間,且隨深度變化較大,-40cm 處∑n-alkanes濃度為 1.19～2.38μg/g,僅為-10cm的 1/20,說明添加的正構(gòu)烷烴主要集中于濕地土壤的表層.

圖1 濕地植物根區(qū)土壤正構(gòu)烷烴各組分的濃度及分布Fig.1 Distributions of n-alkanes in reed rhizosphere soils drip-irrigated with/without river water added diesel oils

蘆葦根區(qū)土壤中多環(huán)芳烴(PAHs)各組分的濃度及分布見圖2.實(shí)驗(yàn)組和對照組蘆葦根區(qū)土壤中均檢測出 14種 PAHs,對照組中高分子量(4～6環(huán))、難生物降解的PAHs占∑PAHs的近50%,且分布在蘆葦整個(gè)生長季內(nèi)無明顯變化,土著微生物對PAHs的降解能力較弱.實(shí)驗(yàn)組PAHs各組分分布與對照組相似,其中萘、芴、菲、芘占∑PAHs比重較高,約為 37.0～74.3%.濃度最高的主要集中于-10cm 土層中,隨著深度的增加迅速減小.實(shí)驗(yàn)組∑PAHs濃度在-10cm處的平均值為963.25ng/g約為-40cm處平均值385.89ng/g的2.5倍.

圖2 濕地植物根區(qū)土壤多環(huán)芳烴各組分的濃度及分布Fig.2 Distributions of PAHs in reed rhizosphere soils drip-irrigated with/without river water added diesel oils

2.2 石油污染對蘆葦根際微生物數(shù)量的影響

細(xì)菌、放線菌和真菌是土壤微生物群落的3種重要組成部分,對有機(jī)物的礦化起著重要作用.實(shí)驗(yàn)初期蘆葦根際的這 3種微生物群落數(shù)量明顯受到石油污染物連續(xù)輸入的影響(表 2).石油污染物的輸入減少蘆葦根際細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量,但增加了根際土壤的有機(jī)質(zhì)和微量元素的含量,促進(jìn)了石油烴降解菌的生長和繁殖[22-23].但經(jīng)過 6個(gè)月灌溉后,除添加石油污染物的細(xì)菌數(shù)量約為未添加的1/4外,實(shí)驗(yàn)組的放線菌和真菌的數(shù)量均與未添加的相近,說明經(jīng)過長時(shí)間的石油輸入,放線菌和真菌已適應(yīng)了石油污染的環(huán)境.石油烴降解菌的數(shù)量則增加了55～215倍.此外,皮爾森相關(guān)分析也表明蘆葦根際微生物種群數(shù)量與正構(gòu)烷烴和多環(huán)芳烴的濃度有明顯關(guān)系(表 3),即污染物濃度越高,微生物種群數(shù)量越小.其中,細(xì)菌對石油最為敏感,根際土壤每一層的細(xì)菌數(shù)量均與氧化還原電位(ORP),正構(gòu)烷烴和多環(huán)芳烴濃度呈顯著的負(fù)相關(guān)性.而放線菌和真菌只是在表層土壤受 ORP,正構(gòu)烷烴和多環(huán)芳烴濃度的影響比較明顯.石油降解菌的數(shù)量與氧化還原電位,正構(gòu)烷烴和多環(huán)芳烴的濃度呈顯著正相關(guān)性(R=0.886～0.978,P<0.01).含水量對蘆葦根際種群數(shù)量的影響并不明顯.

表2 灌溉期內(nèi)蘆葦根區(qū)微生物種群數(shù)量變化Table 2 Microbial abundance of reed rhizosphere soils drip-irrigated with/without river water added diesel oils in six-month irrigation process

表3 微生物種群數(shù)量與土壤參數(shù)及有機(jī)質(zhì)相關(guān)性分析Table 3 Coefficients of Pearson’s correlations between microbial abundances and the soil parameters and organic matters

2.3 石油污染對蘆葦根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

對含油河水灌溉組和對照組各月份-10cm土壤樣品進(jìn)行 DGGE分析,各土壤樣品的變性梯度凝膠電泳(DGGE)譜圖如 3(a)所示.由指紋圖譜可以看出,S1～S12各樣品的條帶數(shù)目,位置和亮度均存在一定的差異性.S1～S6樣品中條帶2均有出現(xiàn)且較亮,而在S7～S12中并不明顯,說明條帶2是石油污染影響下的優(yōu)勢種群.S4樣品中出現(xiàn)了有異于其他樣品的條帶,且條帶數(shù)目較多,說明經(jīng)過長時(shí)間的石油輸入,微生物適應(yīng)了石油污染的環(huán)境,以烴類作為碳源和能源的石油降解菌菌群數(shù)量增加[24-25],與 9月份石油降解菌菌群數(shù)量最高相符.其中條帶1在S1出現(xiàn)后,在S3和S4都均存在,說明該菌群為能降解石油的菌群.S7～S12樣品條帶數(shù)目較 S1～S6多,表明石油污染一定程度上降低了土壤微生物群落多樣性.細(xì)菌圖譜的聚類分析結(jié)果如圖3(b)所示,群落結(jié)構(gòu)最為相似的是S10和S11,其中S6和S9,S7和S8,S1和S3的群落結(jié)構(gòu)分別較相似,S1～S5與S6～S12最后聚在一起,相似性差異較大,進(jìn)一步說明石油污染對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響.根據(jù)蘆葦根際微生物群落DGGE圖譜中出現(xiàn)的優(yōu)勢和特殊條帶進(jìn)行割膠回收測序,測序后其結(jié)果在 GenBank數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行檢索并進(jìn)行同源性比較.15條優(yōu)勢帶的基因片段序列與 GenBank中細(xì)菌序列相似性如表 4.結(jié)果顯示,經(jīng)過 6個(gè)月的含油河水灌溉后,形成了以變形菌門(Proteobacteriumspp.)和擬桿菌門(Bacteroidetesspp.)為主要優(yōu)勢菌的群落結(jié)構(gòu),而厚壁菌門(Firmicutesspp.),放線菌門(Actinobacteriaspp.)和藍(lán)藻門(Cyanobacteriaspp.)則受到不同程度的抑制.

圖3 蘆葦濕地-10cm深度土壤細(xì)菌群落的DGGE分離圖譜及聚類分析樹狀圖譜Fig.3 DGGE profiles of microbial communities of reed rhizosphere soils (-10cm depth) and cluster analysis

表4 測序比對結(jié)果Table 4 Sequence similarities to closest relatives and phylogenetic affiliations of DNA recovered from DGGE gel

3 結(jié)論

3.1 濕地植物根區(qū)主要檢測到 C10～33的正構(gòu)烷烴,含油組正構(gòu)烷烴均為單峰型分布且波峰主要集中在 C13～C26,奇偶優(yōu)勢不明顯且主峰碳數(shù)較低,顯示了石油烴的輸入特征;而未添加柴油對照組各碳數(shù)的分布較為平均且濃度均較低,最高值僅為0.052μg/g.說明微生物降解尤其針對低碳數(shù)的作用明顯.

3.2 含油河水灌溉的總多環(huán)芳烴(∑PAHs)含量是未添加柴油對照組的近10倍,萘、芴、菲、芘在 16種多環(huán)芳烴中所占的比重較大.多環(huán)芳烴(PAHs)的分布特征除濃度增加外變化不明顯,說明濕地植物根區(qū)的多環(huán)芳烴也來源于石油污染,且土著微生物對PAHs的降解能力較弱.

3.3 石油污染物的輸入減少蘆葦根際細(xì)菌的數(shù)量,但促進(jìn)了石油烴降解菌的生長和繁殖.經(jīng)過 6個(gè)月的含油河水灌溉后,添加石油污染物的細(xì)菌的數(shù)量約為未添加的 1/4.而石油烴降解菌的數(shù)量則增加了55～215倍.皮爾森相關(guān)分析也表明蘆葦根際細(xì)菌數(shù)量與根區(qū)土壤中的 ORP,正構(gòu)烷烴和多環(huán)芳烴的濃度有明顯關(guān)系.

3.4 運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)石油污染物質(zhì)連續(xù)輸入的初期階段降低了微生物的數(shù)量,但經(jīng)過 6個(gè)月的自我調(diào)節(jié),微生物數(shù)量在連續(xù)輸入的末期逐漸又恢復(fù)到初期的程度,但微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,形成了以變形菌門(Proteobacteriumspp.)和擬桿菌門(Bacteroidetesspp.)為主要優(yōu)勢菌群的群落結(jié)構(gòu).

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