何婧瑜 王 晶﹡

①首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院急診科 北京 100053

我國每年約54.4萬患者需進(jìn)行心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation，CPR)[1]。CPR后患者全腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷，神經(jīng)元凋亡顯著，神經(jīng)功能嚴(yán)重障礙，最終導(dǎo)致患者死亡或喪失生活能力，抑制神經(jīng)元凋亡成為當(dāng)前促進(jìn)腦復(fù)蘇的研究熱點(diǎn)[2-3]。胰島素是臨床常用的降糖激素，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的進(jìn)展，胰島素抑制神經(jīng)元凋亡的作用逐漸被人們所了解。Duarte等[4]利用皮層神經(jīng)元I/R模型，發(fā)現(xiàn)胰島素可抑制促凋亡基因Caspase-3 mRNA的表達(dá)，減少神經(jīng)元凋亡。目前，胰島素對(duì)于CPR后神經(jīng)系統(tǒng)凋亡的影響研究尚少，本試驗(yàn)研究通過經(jīng)食道超速起搏誘發(fā)室顫，制備大鼠CPR模型，研究腦室內(nèi)注射胰島素通過調(diào)節(jié)Caspase-3 mRNA的表達(dá)，抑制神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

0.1%鹽酸腎上腺素注射液(天津金縷氨基酸有限公司，批號(hào)為0508201)；恩弗烷(河北九派制藥有限公司)；In Situ Cell Death Detection Kit(POD：11 684 817 910)；Real-time PCR引物(上海生工生物技術(shù)公司)；PCR產(chǎn)物純化試劑盒(美國Qiagen)；電子血糖儀(ACCU-CHEK Active)(德國羅氏)；Opticon2 real time PCR and System(美國Transgenomic)；PCR儀(美國Bio-RAD)。

1.2 動(dòng)物及分組

30只健康成年雄性無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)SD大鼠，體重為330～360 g，由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。隨機(jī)分為：①假手術(shù)對(duì)照組(對(duì)照組6只)；②心肺復(fù)蘇組(復(fù)蘇組12只)；③心肺復(fù)蘇后胰島素干預(yù)組(胰島素組12只)。

1.3 經(jīng)食道超速起搏誘發(fā)室顫建立大鼠心肺復(fù)蘇模型

大鼠術(shù)前不禁食，經(jīng)口氣管插管以1%～2%恩弗烷聯(lián)合30%氧氣、70%笑氣混合吸入全麻。分離左側(cè)股動(dòng)靜脈外接MP150生理記錄儀(美國BIOPAC)，監(jiān)測(cè)動(dòng)物血壓、心電圖及肛溫改變，維持體溫(37±0.5)℃。根據(jù)Jia等[5]和Song等[6]提供的方法，經(jīng)大鼠食管超速起搏心臟誘發(fā)室顫，6 min后CPR，經(jīng)股靜脈注射40 μg/kg腎上腺素；根據(jù)大鼠體重，由Harvard小動(dòng)物呼吸機(jī)(美國MA1 55-7058)自動(dòng)設(shè)定通氣頻率，潮氣量為6 ml/kg；人工手法行胸外心臟按壓，頻率為200次/min，按壓深度為大鼠胸廓前后徑1/3；持續(xù)3 min，未復(fù)蘇大鼠進(jìn)行5 J非同步電除顫；總復(fù)蘇時(shí)間＞15 min剔除。大鼠恢復(fù)室上性心率，收縮壓＞60 mm Hg并持續(xù)10 min以上，認(rèn)為復(fù)蘇成功。建模期間不使用其他藥物，復(fù)蘇過程中檢測(cè)各組大鼠血?dú)飧淖儯_保胰島素組和復(fù)蘇組大鼠血?dú)鉄o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，差異顯著予以剔出。

1.4 給藥方式

建模成功后10 min，大鼠分別置于立體定位儀下，于前囟后1.2 mm、左中線水平旁開1.5 mm及深3.5 mm處行腦室內(nèi)微量注射，胰島素組大鼠注射胰島素12.5 μl(1U)、其余組大鼠注射9%生理鹽水12.5 μl，注射過程緩慢，＞10 min。

1.5 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分(neurologic deficit scores，NDS)

按照J(rèn)ia等[6]提供國際通用的NDS80分進(jìn)行評(píng)分，評(píng)價(jià)大鼠的神經(jīng)功能改變，0分代表腦死亡，80分代表大腦功能正常，分值越高其神經(jīng)功能越好。NDS＞60作為大鼠神經(jīng)功能預(yù)后良好的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。復(fù)蘇前3 d評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能，剔出NDS最好或最差的大鼠，排除個(gè)體差異所造成的試驗(yàn)誤差；自主循環(huán)恢復(fù)(return of spontaneous circulation，ROSC)24 h、72 h和7 d后由受專業(yè)訓(xùn)練的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)員對(duì)各組SD大鼠采用雙盲法進(jìn)行獨(dú)立評(píng)分，最終NDS取兩者平均值。

1.6 dUTP缺口末端標(biāo)記(dUTP nick end labeling，TUNEL)法染色

CPR后7 d，將大鼠麻醉后灌注取腦，制備海馬石蠟切片。取視交叉以后由3 mm向后冠狀切開，每隔3張取1張切片，厚度為4 μm，連續(xù)取5張。采用末端脫氧核糖核苷轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的TUNEL法，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行(原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒POD：11684817910)。在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)，凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為核棕染，著色不均，染色質(zhì)向外周分散。400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)每1 mm2高倍視野下凋亡細(xì)胞數(shù)目。5張切片凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)取平均值作為最終結(jié)果

1.7 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)測(cè)定

(1)引物設(shè)計(jì)。參照gen bank公布的引物序列進(jìn)行[7]。引物序列如下：Rat Caspase-3_F：5'-AACCTCCGTGGATTCAAAATC-3；Rat_Caspase-3_R：5'- TTCAAGAGTAATCCATTTTG TAAC-3(NM_012922)Rat_GAPDH_F：5'-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3'；Rat_GAPDH R：5'-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'(NM_01008)。

(2)RT-PCR檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性。大鼠斷頭取腦冰上剝離海馬，取海馬CA1區(qū)0.1 g組織Trizol法提取大鼠海馬總RNA；利用RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)產(chǎn)物的分子量，保證產(chǎn)物的特異性。

(3)熒光實(shí)時(shí)定量PCR半定量Caspase-3 mRNA的表達(dá)量(Opticon2實(shí)時(shí)定量PCR和系統(tǒng)：美國Transgenomic)。在同一反應(yīng)中，用標(biāo)準(zhǔn)曲線校正不同實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬組織中GAPDH、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平，測(cè)得的值分別與該組的GAPDH比較得出每個(gè)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的mRNA表達(dá)水平的相對(duì)定量。

1.8 監(jiān)測(cè)心肺復(fù)蘇組及胰島素組血糖改變

測(cè)定大鼠心肺復(fù)蘇前、復(fù)蘇時(shí)、復(fù)蘇后1 h、復(fù)蘇后2 h以及復(fù)蘇后24 h血糖。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)結(jié)果由計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)包Spss 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()，組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用中位數(shù)(25 th～75 th百分位數(shù))，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性統(tǒng)計(jì)應(yīng)用Pearson相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 胰島素組與復(fù)蘇組大鼠海馬CA1區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)促凋亡基因Caspase-3 mRNA表達(dá)量

CPR后24 h和72 h，胰島素組促凋亡因子Caspase-3 mRNA表達(dá)量低于復(fù)蘇組，胰島素組及復(fù)蘇組Caspase-3 mRNA表達(dá)分別為：CPR后24 h(0.43±0.03，1.39±0.36，P＜0.05)；CPR后72 h(0.63±0.06，1.08±0.05，P＜0.05)；胰島素組72 h促凋亡因子Caspase-3 mRNA表達(dá)量高于24 h(0.43±0.03，0.63±0.06，P=0.006)，復(fù)蘇組各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3 mRNA表達(dá)量無差異(1.39±0.36，1.08±0.05，P＞0.05)。

2.2 各組大鼠CPR后7 d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元TUNEL染色的結(jié)果

經(jīng)400倍顯微鏡放大觀察，胰島素組與復(fù)蘇組海馬與皮層散布棕色細(xì)胞，以海馬區(qū)最為密集(如圖1所示)。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL染色情況

在高倍視野下計(jì)數(shù)1 mm2陽性染色細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組凋亡細(xì)胞(5.12±3.26/mm2)比較，復(fù)蘇組凋亡細(xì)胞(124.75±17.35/mm2)明顯增高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=586.229，P＜0.001)；胰島素組凋亡細(xì)胞(92.79±7.5/mm2)低于復(fù)蘇組凋亡細(xì)胞(124.75±17.35/mm2)(F=5.853，P=0.02)；但胰島素組凋亡細(xì)胞高于對(duì)照組凋亡細(xì)胞，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1685.336，P＜0.001)。

2.3 各組大鼠復(fù)蘇前、復(fù)蘇后24 h、72 h和7 d的NDS

復(fù)蘇前各組大鼠無顯著的神經(jīng)功能缺陷；建模成功后對(duì)照組大鼠各時(shí)間點(diǎn)無功能缺陷。與對(duì)照組相比，復(fù)蘇組及胰島素組大鼠CPR后24 h和72 h神經(jīng)功能缺失顯著；CPR后7 d，NDS恢復(fù)，其結(jié)果復(fù)蘇組與對(duì)照組相比24 h和72 h均為P＜0.001；而7 d則P=0.395；胰島素組與對(duì)照組相比24 h和72 h均為P＜0.001；而7 d則P=0.394。胰島素組與復(fù)蘇組比較CPR后24 h，胰島素組NDS高于復(fù)蘇組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；72 h評(píng)分胰島素組略高于復(fù)蘇組，但兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.114)；CPR后7 d胰島素組與復(fù)蘇組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.973)(見表1)。

表1 各組大鼠不同時(shí)間NDS評(píng)分結(jié)果

2.4 相關(guān)性檢測(cè)

①24 hNDS評(píng)分與24 hCaspsase-3 mRNA、72 h Caspase-3 mRNA表達(dá)量負(fù)相關(guān)(r=-0.961，P=0.002；r=-0.903，P=0.014)。

②24 h NDS，72 h NDS與7 d凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.893，P=0.03；r=-0.767，P=0.026)。

2.5 腦室內(nèi)注射1U胰島素對(duì)于血糖的影響

胰島素組與復(fù)蘇組CPR前、CPR時(shí)和CPR后1 h、2 h和24 h靜脈血糖值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CPR前胰島素組與復(fù)蘇組血糖(mmol/L)分別為44±1.61和6.32±0.74，P＞0.05；CPR時(shí)血糖為0.06±2.31和9.24±2.66，P＞0.05；CPR 1 h時(shí)血糖為8.46±3.16和7.78±3.28，P＞0.05；CPR 2 h時(shí)血糖為5.10±1.82和6.3±3.84，P＞0.05；CPR 24 h時(shí)血糖為6.40±2.27和7.40±1.17，P＞0.05。

3 討論

CPR后腦缺血缺氧再灌注損傷，導(dǎo)致TFN-α，IL-6等大量釋放，與神經(jīng)元受體表面死亡受體Fas等結(jié)合，激活外源性凋亡通路如Caspases(半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致DNA斷裂，神經(jīng)元凋亡[8]。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)14種不同的Caspases，活化的Caspases參與許多細(xì)胞學(xué)凋亡特征的改變。正常神經(jīng)元中Caspase-3主要以惰性蛋白酶原Procaspase-3的形式存在于胞質(zhì)中，其分子量為32 kDa，僅存在微量表達(dá)的Caspase-3的活性亞基。Guan等[9]應(yīng)用大鼠血管夾閉全腦缺血再灌注模型發(fā)現(xiàn)，缺血、缺氧等傷害性刺激促使Caspase-3表達(dá)增高，胞質(zhì)內(nèi)無活性的Procaspase-3惰性蛋白酶原裂解為分子量12 kDa和17 kDa的Caspase-3活性亞基，通過多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)源性和外源性凋亡通路，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡；全面抑制Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)或僅抑制Caspase-3激活、表達(dá)均表現(xiàn)出抑制神經(jīng)元調(diào)亡的作用。Teschendorf等[10]利用6 min室顫法制備CPR模型證實(shí)，Caspase-3表達(dá)與海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡顯著正相關(guān)。Caspases-3是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)器，是腦缺血過程中肯定的負(fù)面惡化因素[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組大鼠為排除體內(nèi)過剩及有害的細(xì)胞，維持正常的生理機(jī)能，僅小部分細(xì)胞自發(fā)性凋亡(如圖1A所示)；6 min室顫后大鼠CPR全腦嚴(yán)重缺血再灌注損傷，其機(jī)體病態(tài)啟動(dòng)神經(jīng)元凋亡程序，誘導(dǎo)大量神經(jīng)元凋亡，CPR后7d海馬及其對(duì)皮層神經(jīng)元凋亡顯著，以海馬區(qū)域最為密集(如圖1B、圖1C所示)：CPR造成以凋亡為特點(diǎn)的嚴(yán)重的遲發(fā)性神經(jīng)元損傷，以海馬最為嚴(yán)重[11]。CPR后10 min一次性腦室注射1 U胰島素，至少可以在7 d內(nèi)抑制海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡(如圖1B所示)。

探究胰島素抑制神經(jīng)元凋亡的作用機(jī)制，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)胰島素對(duì)于外源性抑制凋亡因子Caspase-3表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇組大鼠CPR后72 h Caspase-3 mRNA表達(dá)量略低于24 h，但兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明CPR后24 h和72 h Caspase-3 mRNA在一定水平穩(wěn)定表達(dá)持續(xù)介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。CPR后24 h和72 h胰島素組Caspases-3 mRNA表達(dá)量顯著低于復(fù)蘇組，表明胰島素能夠抑制Caspases-3的表達(dá)，影響外源性凋亡通路，抑制神經(jīng)元凋亡；胰島素組72 h Caspases-3定量高于24 h，表明胰島素可能延遲了Caspase-3產(chǎn)生高峰從另一側(cè)面發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)；同時(shí)表明，胰島素抗凋亡作用存在“劑量依賴效應(yīng)”，隨著時(shí)間的推移，腦室胰島素代謝增加，胰島素濃度水平降低，抑制凋亡的作用降低。由此推測(cè)，胰島素一次性干預(yù)不足以完全阻斷凋亡級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過程取得最好的療效，持續(xù)給予胰島素可能會(huì)收到更好的效果。

應(yīng)用NDS評(píng)價(jià)胰島素對(duì)于CPR后神經(jīng)功能的影響發(fā)現(xiàn)，胰島素能夠改善CPR后大鼠NDS；胰島素組神經(jīng)功能評(píng)分均＞60，提示大鼠預(yù)后良好。結(jié)合NDS與Caspase-3 mRNA及凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)性分析，24 h NDS評(píng)分與24 h和72 h促凋亡因子Caspase-3表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，與7 d凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，而CPR后72 h其NDS與上述檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性降低，甚至不相關(guān)，此現(xiàn)象表明：①CPR后24 h Caspase-3表達(dá)越高，高峰持續(xù)時(shí)間越長，神經(jīng)元凋亡越多，神經(jīng)評(píng)分越低，大鼠神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重[12]；②胰島素通過抑制促凋亡因子的表達(dá)，抑制神經(jīng)元凋亡，改善CPR后神經(jīng)功能障礙；③24 h NDS評(píng)分對(duì)于神經(jīng)元凋亡程度具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值；超出24 h其NDS與凋亡指標(biāo)的相關(guān)性降低，NDS對(duì)于凋亡的預(yù)測(cè)能力降低，因此需要探索其他方法預(yù)測(cè)凋亡。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦室內(nèi)注射胰島素對(duì)于外周血糖無影響，表明胰島素通過與中樞胰島素受體結(jié)合啟動(dòng)特異的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制[13]。獨(dú)立于降低應(yīng)激后血糖的作用發(fā)揮神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用與Hui等[14]的試驗(yàn)結(jié)果一致。

綜上所述，本試驗(yàn)從基因半定量、形態(tài)學(xué)及功能評(píng)分等多方面的研究表明，一次性腦室內(nèi)注射胰島素至少在7 d內(nèi)能夠調(diào)節(jié)CPR后抑凋亡因子Caspases-3的表達(dá)，抑制神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能評(píng)分，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[15]。而胰島素如何通過胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)Caspases-3的表達(dá)機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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