石桂英，張海濤，張連峰，白 琳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021)

載脂蛋白E(apolipoprotein E，Apo E)是一種多態(tài)性蛋白，參與脂蛋白的轉(zhuǎn)化與代謝過程，其基因可以調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能［1］。Apo E基因敲除后，小鼠的B淋巴細胞及T淋巴細胞發(fā)生改變［2］，Apo E在造血干祖細胞中表達豐富，Apo E基因敲除小鼠喂飼高脂、高膽固醇飼料后，造血干祖細胞顯著增多［3］，這說明在高脂、高膽固醇可以誘導(dǎo) Apo E基因敲除小鼠造血干祖細胞增殖。那么在沒有高脂、高膽固醇誘因下，Apo E基因?qū)π∈笤煅勺婕毎袥]有影響呢?

造血干細胞是所有成熟血細胞維持的重要因素。在生理狀態(tài)下，造血干細胞面臨多種命運選擇:自我更新、分化、凋亡、靜息或遷移，這些選擇之間的平衡決定了造血干細胞的功能［4］。不同命運的選擇是由內(nèi)在(細胞周期、凋亡等相關(guān)基因)和外在(微環(huán)境)的調(diào)控機制共同決定的［5］。但是造血干細胞維持自我更新和選擇分化的具體機制還不清楚。

那么Apo E對造血系統(tǒng)有怎樣的作用，是否會影響骨髓造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSC)的發(fā)育分化呢?為了解Apo E基因敲除是否會影響HSC，我們應(yīng)用Apo E基因敲除小鼠及同窩野生對照小鼠進行了相關(guān)分析。

1 材料和方法

1.1 動物與設(shè)備

Apo E基因敲除小鼠來自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，遺傳背景為C57B6/L，對照小鼠為同窩野生型小鼠，動物生產(chǎn)及使用許可證號:SCXK(京)2009－0007;SYXK(京)2011－0022。動物飼養(yǎng)在SPF動物房，喂飼SPF級小鼠維持飲料。

主要實驗設(shè)備為美國BD公司Aria流式細胞儀。

1.2 PCR方法鑒定Apo E基因敲除小鼠基因型

用10日齡小鼠尾尖提取基因組 DNA，普通PCR鑒定基因型。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個循環(huán);72℃延伸10 min?；蚯贸∈蟮?PCR鑒定引物:OIMR0180:5`GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG 3`，OIMR 0181:5`TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C 3`，OIMR 0182:5`GCC GCC CCG ACT GCA TCT 3`，PCR產(chǎn)物長度，野生型為155 bp，Apo E敲除為245 bp，雜合子同時有上述2條片段。引物由上海英駿生物工程技術(shù)有限公司合成，PCR試劑購自寶生物工程有限公司。

1.3 流式分析

小鼠2月齡時脫頸椎處死，取外周血、胸腺、脾臟、后肢骨，置于冰上預(yù)冷的染色緩沖液(含1%BSA的PBS)中。胸腺、脾臟用磨砂玻片研磨成細胞懸液;后肢骨用5 mL注射器將骨髓細胞沖出，并吹打成細胞懸液。將細胞懸液用50 μm尼龍濾膜過濾后收集到15 mL離心管中，用PBS定容至10 mL，混勻后，取10 μL細胞懸液，稀釋10倍后計數(shù)細胞數(shù)。細胞懸液離心，1000 r/min，10 min，將細胞濃度調(diào)整為1×108個細胞/mL。分別取106細胞標記熒光抗體(BD公司)。

骨髓造血干細胞的分析中用如下抗體進行標記:CD34－FITC、Flt3－PE、CD16/32－ Pcrcp－cy5.5、Sca1－ PE－Cy7、cKit－ APC、Ter－119－ Biotin、Gr－1－Biotin、Mac－1－ Biotin、B220－ Biotin、IL－7R－ Biotin、CD4－Biotin、CD8－Biotin、Biotin －APC－Cy7。骨髓造血干細胞(HSC)表面標記為:lin－c－kit+sca1+，長期造血干細胞(LT－HSC)表面標記為:Lin－ c－Kit+Sca1+CD34－Flt3－，短期造血干細胞(ST－HSC)表面標記為:Lin－c－Kit+Sca1+CD34+Flt3－，髓系祖細胞(MP)表面標記為:Lin－c－Kit+Sca1－，共同髓系祖細胞(CMP)表面標記為:Lin－ c－Kit+Sca1－CD34+CD16/32low，粒單系祖細胞(GMP)表面標記為:Linc－Kit+Sca1－CD34+CD16/32high，巨核單系祖細胞(MEP)表面標記為:Lin－c－Kit+Sca1－CD34－CD16/32low，淋系共同祖細胞(CLP)的表面標記為:Lin－ckitlowSca1lowCD34+IL － 7R+。IgD－FITC、CD43－PE、B220－PE－Cy7、IgM－APC，標記不同發(fā)育階段的 B 淋巴細胞。脾臟及外周血細胞標記抗體:CD4－FITC、CD8－Pcrcp－cy5.5、B220－PE－Cy7、CD11B－ APC－Cy7。上述抗體加入細胞懸液，冰上避光，30 min;加1 mL染色緩沖液，離心，2600 r/min，5 min，棄上清，加200 μL染色緩沖液重懸細胞，用50 μm尼龍濾膜過濾，冰上避光備用。

1.4 統(tǒng)計分析方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)均采用±s表示。組間資料分析采用t檢驗。以P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR鑒定結(jié)果

剪取10日齡小鼠腳趾，采用飽和氯化鈉法提取小鼠基因組DNA，進行PCR，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，野生型產(chǎn)物長度為155 bp，Apo E缺失產(chǎn)物長度245 bp?；蛐丸b定結(jié)果(圖1)。

2.2 Apo E基因敲除小鼠外周血B細胞、T細胞減少

我們?nèi)po E基因敲除小鼠及同窩野生對照小鼠的外周血進行分析，發(fā)現(xiàn)Apo E基因敲除小鼠外周血中B220+細胞(P＜0.05)及T淋巴細胞(P＜0.01)顯著減少，而CD11b+細胞則沒有顯著變化(P＞0.05)。

注:Marker為2000 bp DNA Marker，7－15為小鼠編號，+/－為雜合對照，H2O為陰性對照。圖1 Apo E基因敲除小鼠鑒定結(jié)果Note:Marker:2000 bp DNA marker;7 －15:No.of different mice;+/－:heterozygous control;H2O:negative control.Fig.1 Genotyping of Apo E knockout mice

注:Apo E+/+:同窩野生對照小鼠，Apo E－/－:Apo E基因敲除小鼠。圖2 Apo E基因敲除影響外周血B220+細胞及T淋巴細胞Note:Apo E+/+:wildtype control mice;Apo E－ /－:Apo E gene knockout mice.Fig.2 Apo E gene knockout influences the B220+cells and T lymphocytes of peripheral blood

2.3 Apo E基因敲除對小鼠骨髓及脾臟中B220+細胞的影響

Apo E基因敲除小鼠外周血中B220+細胞減少，本研究對骨髓及脾臟的細胞進行了分析，同時對骨髓中前體B細胞的發(fā)育也進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Apo E基因敲除小鼠脾臟B220+細胞減少(P＜0.05)，但是骨髓中B220+細胞無顯著改變(P＞0.05)。同時，骨髓中前體B細胞的發(fā)育也沒有顯著變化(P ＞0.05)。

注:A:骨髓及脾臟中B220+細胞比例;B:骨髓前體B細胞、未成熟B細胞及成熟B細胞的比例。圖3 Apo E基因敲除對骨髓及脾臟B220+細胞的影響Note:A:percent of B220+cells in the bone marrow and spleen;B:percent of pre B，immature B，mature B cells in the bone marrow.Fig.3 Influence of Apo E knockout on the B220+cells in bone marrow and spleen

2.4 Apo E基因敲除小鼠T細胞變化

Apo E基因敲除小鼠外周血T淋巴細胞減少，為了解骨髓及脾臟T淋巴細胞的變化，本研究分析了骨髓、脾臟中CD4+、CD8+細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脾臟中CD4+細胞比例增多(P＜0.01)，而CD8+細胞比例降低(P＜0.05);骨髓中則未發(fā)現(xiàn)顯著變化(P＞0.05圖4A)。為進一步了解Apo E基因敲除對小鼠T淋巴細胞發(fā)育的影響，我們分析了胸腺T淋巴細胞，結(jié)果顯示，各階段T淋巴細胞的比例沒有顯著變化(P＞0.05)圖4B)。這說明，Apo E基因敲除對T淋巴細胞發(fā)育沒有顯著影響。

注:A:骨髓及脾臟CD4+、CD8+細胞的比例;B:胸腺中各階段T細胞的比例;DN:CD4、CD8雙陰性細胞，DP:CD4、CD8雙陽性細胞。圖4 Apo E基因敲除對T淋巴細胞的影響Note:A:percent of CD4+、CD8+cells in the bone marrow and spleen;B:percent of different stages T lymphocytes in the thymus;DN:CD4，CD8 double negative cells，DP:CD4，CD8 double positive cells.Fig.4 Influence of Apo E knockout on T lymphocytes

2.5 Apo E基因敲除對骨髓造血干細胞的影響

為了解Apo E基因敲除對小鼠骨髓造血干細胞的影響，本研究分析了Apo E基因敲除小鼠及同窩野生對照小鼠骨髓造血干細胞的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)Apo E基因敲除小鼠短期造血干細胞(ST－HSC)數(shù)量顯著增加(P ＜0.05)，長期造血干細胞(LT－HSC)、多潛能造血祖細胞(MPP)及淋系共同祖細胞(CLP)則沒有顯著變化(P＞0.05)。造血干細胞的功能是否改變，則需進行骨髓移植實驗來深入研究。

注:LT:長期造血干細胞，ST:短期造血干細胞，MPP:多潛能造血祖細胞，CLP:淋系共同祖細胞。圖5 Apo E基因敲除對骨髓造血干細胞的影響Note:LT:long term HSC，ST:short term HSC，MPP:multipotential progenitors，CLP:common lymphoid progenitor.Fig.5 Influence of Apo E knockout on the hematopoietic stem cell(HSC)

3 討論

已有研究表明，Apo E基因參與免疫調(diào)節(jié)作用，Apo E基因敲除小鼠的體液免疫及細胞免疫均發(fā)生改變［6］。Apo E基因敲除小鼠在3月齡時已出現(xiàn)脂肪條紋，即動脈粥樣硬化早期的損傷性表現(xiàn)［1］。本研究中采用2月齡小鼠作為研究對象喂飼正常小鼠維持飼料，避免了Apo E基因敲除所致疾病對研究目標的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，Apo E基因敲除后小鼠造血系統(tǒng)B220+、CD4+、CD8+淋巴細胞在外周組織中發(fā)生變化，骨髓短期造血干細胞顯著增加(P＜0.05)，但是骨髓長期造血干細胞及胸腺T細胞則沒有顯著變化(P＞0.05)。這說明Apo E基因可能通過免疫調(diào)節(jié)作用影響B(tài)220+、CD4+、CD8+淋巴細胞。Apo E基因?qū)撬柙煅杉毎淖晕腋录胺只δ苁欠裼杏绊?，尚需?yīng)用競爭性骨髓移植、體外克隆形成實驗等進一步深入研究。

［1］Reue KL，Quon DH，O'Donnell KA，et al.Cloning and regulation of messenger RNA for mouse apolipoprotein E.The Journal of biological chemistry［J］.1984，259(4):2100－2107.

［2］Ali K，Middleton M，Pure E，et al.Apolipoprotein E suppresses the type I inflammatory response in vivo.Circulation research［J］.2005，97(9):922－927.

［3］Murphy AJ，Akhtari M，Tolani S，et al..ApoE regulates hematopoietic stem cell proliferation，monocytosis，and monocyte accumulation in atherosclerotic lesions in mice.The Journal of clinical investigation［J］.2011，121:4138 －4149.

［4］Kobayashi M，Srour EF.Regulation of murine hematopoietic stem cell quiescence by Dmtf1.Blood［J］.2011，118:6562－6571.

［5］Pietras EM，Warr MR，Passegue E.Cell cycle regulation in hematopoietic stem cells.The Journal of cell biology［J］.2011，195:709－720.

［6］Laskowitz DT，Lee DM，Schmechel D，et al..Altered immune responses in apolipoprotein E－deficient mice.Journal of lipid research［J］.2000，41:613 －620.