于保鋒，劉志貞，張悅紅，解 軍，程牛亮，王建華，牛 勃，(山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，太原 0000;山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;首都兒科研究所生物技術(shù)研究室;通訊作者，E-mail:niub004@6.com)

蚯蚓是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的重要藥材之一，現(xiàn)代研究表明其提取物具有抗凝［1，2］和抗腫瘤［3，4］等作用。本課題組從赤子愛勝蚓cDNA文庫中獲得一cDNA序列，經(jīng)初步分析，其編碼的蛋白屬于新蛋白，序列比對表明，其編碼序列與Eisenstasin和Antistasin蛋白具有同源性，可能具有抗凝和抗腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)活性，為進(jìn)一步的研究其結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

從本室構(gòu)建和保存的赤子愛勝蚓cDNA文庫中經(jīng)隨機(jī)測序獲得本目標(biāo)cDNA序列，利用基因和蛋白質(zhì)分析處理軟件DNAMAN、NCBI ORF finder、BLAST、Conserved Domains、GOR、SWISS－MODEL等軟件對該目標(biāo)的基因序列和氨基酸序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 Eisenstasin樣蛋白的cDNA序列

采用美國ABI公司3730基因測序儀，測序結(jié)果得到的Eisenstasin樣蛋白的cDNA序列如下:

DNAMAN軟件分析得到，序列總長度565 bp;堿基組成:165 A，118 C，152 G，130 T;堿基組成百分比:29.2%A，20.9%C，26.9%G，23.0%T;分子量(molecular weight，單位:kD):ssDNA(單鏈 DNA):175.27，dsDNA(雙鏈 DNA):348.31。

2.2 Eisenstasin樣蛋白的氨基酸序列

將上述cDNA序列用NCBI ORF finder軟件(網(wǎng)址 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)進(jìn)行分析，得到其氨基酸序列如下:

氨基酸用大寫英文字母的一字縮寫表示，可見讀碼框架從cDNA序列的第120位核苷酸開始，起始密碼ATG對應(yīng)甲硫氨酸(英文縮寫M)。共編碼148個氨基酸殘基。

2.3 Eisenstasin樣蛋白cDNA序列的同源比對

將上述Eisenstasin樣蛋白的cDNA序列用在線nucleotide blast工具進(jìn)行同源比對，結(jié)果如圖1(見第339頁)所示，可見有3個命中結(jié)果序列。與目標(biāo)序列同源度最高的命中序列為Eisenia andrei Eisenstasin I mRNA的編碼序列，兩者核苷酸的相似度為78%(148/190，見圖2)。相似度次之的為Eisenia andrei EisenstasinⅡ mRNA的編碼序列，兩者核苷酸的相似度為72%(187/260，見圖3)。

圖2 Eisenstasin樣蛋白與EisenstasinⅠcDNA序列的比對Figure 2 Comparison of sequences between Eisenstasin-like protein and EisenstasinⅠcDNA

圖3 Eisenstasin樣蛋白與EisenstasinⅡcDNA序列的比對Figure 3 Comparison of sequences between Eisenstasin like protein and EisenstasinⅡcDNA

2.4 Eisenstasin樣蛋白氨基酸序列的同源比對

將上述Eisenstasin樣蛋白的氨基酸序列用在線protein blast工具進(jìn)行同源比對，可見有359個命中結(jié)果序列(圖4，見第339頁)。與目標(biāo)序列同源度最高的命中序列為Eisenia andrei EisenstasinⅡ的氨基酸序列，兩者氨基酸的相似度為37%(61/166，見圖5)。

2.5 Eisenstasin樣蛋白cDNA序列中保守結(jié)構(gòu)域分析

將Eisenstasin樣蛋白cDNA序列用NCBI Conserved Domains工具進(jìn)行分析，檢索其序列中可能存在的保守功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示目標(biāo)序列中存在3段Antistasin家族保守結(jié)構(gòu)域(圖6，見第339頁)。該保守結(jié)構(gòu)域中的共有氨基酸序列(圖7，見第340頁)。

2.6 基于Eisenstasin樣蛋白氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖5 Eisenstasin樣蛋白與EisenstasinⅡ氨基酸序列的比對Figure 5 Comparison of Eisenstasin-like protein and EisenstasinⅡamino acid sequence

將上述Eisenstasin樣蛋白的氨基酸序列用蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測在線工具GORⅣ進(jìn)行分析，預(yù)測結(jié)果如圖8(見第340頁)所示，148個氨基酸殘基中，44個(29.73%)氨基酸殘基主要形成β折疊結(jié)構(gòu)，其余104個(70.27%)氨基酸殘基主要形成無規(guī)卷曲(random coil)結(jié)構(gòu)，沒有出現(xiàn)α螺旋和β轉(zhuǎn)角的二級結(jié)構(gòu)形式。對Antistasin蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行同法預(yù)測，220個氨基酸殘基中，12個(5.45%)氨基酸殘基主要形成α螺旋結(jié)構(gòu)，42個(19.09%)氨基酸殘基主要形成β折疊(extended strand)結(jié)構(gòu)，其余166個(75.45%)氨基酸殘基主要形成無規(guī)卷曲(random coil)結(jié)構(gòu)。

2.7 Eisenstasin樣蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

將上述Eisenstasin樣蛋白的氨基酸序列用蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測的同源建模工具SWISS－MODEL進(jìn)行分析，結(jié)果如圖9(見第340頁)所示，可見結(jié)構(gòu)中多見β折疊和無規(guī)卷曲，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果相一致。

圖7 Antistasin家族保守結(jié)構(gòu)域中的共有氨基酸序列Figure 7 The consensus amino acid sequences in conserved domains of Antistasin family

圖8 Eisenstasin樣蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Figure 8 The secondary structure prediction results of Eisenstasin-like protein

圖9 Eisenstasin樣蛋白的預(yù)測三級結(jié)構(gòu)Figure 9 Predictive tertiary structure of Eisenstasin-like protein

3 討論

Antistasin，分子量為 15 000，是 1987年 Gasic等［5］最早從墨西哥藥用南美水蛭的唾液中獲得的一種蛋白，可以抑制血凝與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［6，7］。Eisenstasin是Joo等［8］從安德愛勝蚓組織中發(fā)現(xiàn)并克隆的蛋白，可特異抑制凝血因子Ⅹa的活性。蚯蚓組織中的抗凝活性物質(zhì)也多早有報道［1，2］，但對于其具體活性成分并不清楚，因此本文報道的赤子愛勝蚓組織中Eisenstasin樣蛋白，具有重要的研究和應(yīng)用價值。

從赤子愛勝蚓cDNA文庫中獲得Eisenstasin樣蛋白的基因序列后，經(jīng)同源比對分析，其基因和蛋白序列與Antistasin和Eisenstasin蛋白的序列同源性較高，而且還發(fā)現(xiàn)了Antistasin家族的保守蛋白結(jié)構(gòu)域，因此推測此次從赤子愛勝蚓中發(fā)現(xiàn)的該蛋白質(zhì)具有同Antistasin和Eisenstasin相似的抗凝血作用，也可能具有抗腫瘤侵襲的作用。

但由于本課題組尚未獲得該蛋白的基因克隆，因此僅通過軟件預(yù)測對其同源性和二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果，Eisenstasin樣蛋白的二級結(jié)構(gòu)與Antistasin高度相似，主要以β折疊和無規(guī)卷曲的二級結(jié)構(gòu)形式為主。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，也可看到空間結(jié)構(gòu)中的β折疊和無規(guī)卷曲為主的結(jié)構(gòu)，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果是一致的。因此推測本課題組發(fā)現(xiàn)的Eisenstasin樣蛋白應(yīng)具有和Antistasin相似的功能。進(jìn)一步研究該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能需要克隆該蛋白的基因序列，并構(gòu)建表達(dá)克隆，表達(dá)出該蛋白質(zhì)，進(jìn)行功能活性實(shí)驗(yàn)研究。

總之，本研究為進(jìn)一步Eisenstasin樣蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

［1］ 朱長連，王小陽，張國禎，等.蚯蚓提取物的纖溶和抗凝作用［J］.河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1993，28(1):15 －17.

［2］ 韓彩芝，余素清，李秀芳，等.蚯蚓提取液纖溶及抗凝作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國生化藥物雜志，1997，18(5):252 －254.

［3］ 何道偉，陳洪，葉銀英.蚯蚓提取物體內(nèi)和體外抗腫瘤作用的研究［J］.中國生化藥物雜志，2005，26(6):353 －355.

［4］ 謝江碧，賀衛(wèi)國，翁寧，等.蚯蚓中抗腫瘤蛋白組分的提取分離及其抗腫瘤活性［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2003，19(3):359－366.

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［8］ Joo SS，Won TJ，Kim JS，et al.Inhibition of coagulation activation and inflammation by a novel Factor Xa inhibitor synthesized from the earthworm Eisenia andrei［J］.Biol Pharm Bull，2009，32(2):253－258.