楊碩 王娟 萬幸 賀恒 李斌 劉磊

糖尿病是一種糖代謝異常的全身性疾病，眼部并發(fā)癥主要包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病角膜病變、糖尿病性白內(nèi)障等。糖尿病角膜病變主要表現(xiàn)為角膜上皮的缺損、淺表潰瘍以及各種角膜炎等［1-2］，給糖尿病患者造成嚴(yán)重的視覺威脅。目前針對糖尿病角膜病變的主要方法是表面潤滑和抗生素治療，所有這些方法都是在努力創(chuàng)建一種有效的促進角膜損傷愈合的環(huán)境。但是這些方法并沒有很好地解決糖尿病角膜病變傷口愈合延遲［3］。尋求一種有效的新方法是糖尿病角膜病變研究的核心問題。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種因子與糖尿病角膜病變有密切關(guān)系［4-6］。我們在對糖尿病并發(fā)眼部疾病的研究過程中，對糖尿病小鼠自然飼養(yǎng)環(huán)境下發(fā)生的角膜損傷、角膜潰瘍進行了形態(tài)學(xué)觀察。旨在了解糖尿病小鼠角膜病變發(fā)生發(fā)展的過程，對后期進行的糖尿病角膜病變保護因子的研究提供部分形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SPF級C57BL/J小鼠30只(華中科技大學(xué)實驗動物中心)，7～8周齡，雌雄不限。隨機分為2組。正常對照組10只，實驗組(糖尿病造模組)20只。

1.2 糖尿病小鼠造模 開始造模前C57BL/J小鼠禁食12 h，腹腔連續(xù)5 d注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美國 Sigma 公司)45 mg·kg－1。最后一次注射后7 d，采用割尾法取血，快速血糖儀(美國強生公司)檢測血糖，血糖值大于15.7 mmol·L－1為造模成功［7-8］。每月進行血糖檢測，未達標(biāo)者淘汰出實驗組。正常對照組同步處理，檢測血糖。實驗組共有18只小鼠血糖為高血糖。造模后6個月時4只小鼠存在單眼角膜潰瘍，并沒有小鼠雙眼出現(xiàn)潰瘍改變;正常對照組小鼠血糖為 4.0 ～7.0 mmol·L－1。

1.3 角膜取材 正常條件下飼養(yǎng)糖尿病小鼠，分別在造模后3個月、6個月時進行角膜取材。水合氯醛腹腔注射麻醉后，打開胸腔，40 g·L－1多聚甲醛(湖北百奧斯生物)進行心臟灌注，小心取出眼球，置于40 g·L－1多聚甲醛中于4℃固定24 h，石蠟包埋，組織切片，厚度為4 μm，HE染色(HE染液由湖北百奧斯生物配制)。光鏡下觀察并照相(×20)。

2 結(jié)果

正常對照組角膜結(jié)構(gòu)致密，上皮完整(圖1)。造模后3個月糖尿病小鼠角膜基質(zhì)水腫，部分出現(xiàn)疏松改變，角膜上皮較完整。造模后6個月糖尿病小鼠角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重稀疏、水腫、增厚，上皮無明顯缺失，其中發(fā)生潰瘍的角膜，越靠近潰瘍區(qū)水腫、增厚尤甚，潰瘍區(qū)角膜上皮缺損。造模后3個月、6個月糖尿病小鼠角膜變化總體為漸進性病變，隨病程增加，損害加重(圖2-圖4)。

Figure 1 The corneal structures arranged closely with complete epithelium in control group圖1 正常對照組小鼠角膜結(jié)構(gòu)致密，上皮完整。

.Figure 2 Mild corneal edema with thick stroma appeared in diabeticmice at 3 months after model establishment圖2 造模后3個月糖尿病小鼠角膜，可見部分基質(zhì)水腫，疏松改變。

.Figure 3 Corneal stroma with no ulcer was edema and thicken with disorder structure and complete epithelium in diabeticmice at 6 months after model establishment圖3 造模后6個月糖尿病小鼠未發(fā)生潰瘍的角膜，可見基質(zhì)增厚、水腫，結(jié)構(gòu)疏松，上皮完整。

.Figure 4 Epithelium around the corneal ulcer was incomplete，and the extent of thickening and edema in ulcer area was higher than that in non-ulcer area significantly in diabeticmice at 6 months after model establishment圖4 造模后6個月糖尿病小鼠已發(fā)生角膜潰瘍，可見基質(zhì)層水腫、疏松程度明顯大于未潰瘍眼和3個月糖尿病眼，潰瘍區(qū)(箭頭所指)上皮殘缺，基質(zhì)水腫、疏松明顯高于非潰瘍區(qū)

3 討論

糖尿病是一種具有嚴(yán)重危害的全身性代謝性疾病，糖尿病角膜病變是一種糖尿病主要的眼表并發(fā)癥，有47%～64%糖尿病患者會發(fā)生角膜損傷性的上皮病變［1］。隨著糖尿病患者數(shù)量的增多，可以估計，角膜病變將會是擺在眾多糖尿病患者面前的一個嚴(yán)重問題。正常角膜上皮細胞通常是作為一種防止眼部感染的屏障，對維持角膜的透明性和完整性有重要作用［3］。糖尿病患者由于自身病理生理異常，代謝紊亂，導(dǎo)致角膜上皮細胞發(fā)生異常，出現(xiàn)角膜損傷后愈合緩慢，上皮細胞松散，黏附性降低。在組織形態(tài)變化上，角膜上皮和內(nèi)皮細胞形態(tài)改變，基質(zhì)水腫、增厚［3，9-10］。

目前，關(guān)于糖尿病角膜病變的相關(guān)研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種相關(guān)的因子與糖尿病角膜病變發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。表皮生長因子、胰島素樣生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子等在糖尿病角膜病變過程中發(fā)揮了一定的作用［4-6］。我們在長期的糖尿病小鼠造模過程中發(fā)現(xiàn)，自然環(huán)境下發(fā)生糖尿病的小鼠會有部分小鼠出現(xiàn)單眼角膜潰瘍性改變。我們選取了6個月中發(fā)生單眼潰瘍糖尿病小鼠，HE染色對比觀察潰瘍眼和無潰瘍眼角膜以及3個月、6個月糖尿病小鼠角膜的形態(tài)變化。糖尿病小鼠造模后3個月角膜開始出現(xiàn)基質(zhì)水腫、增厚，結(jié)構(gòu)松散，角膜剛性結(jié)構(gòu)改變，但上皮大部分完整性尚可，這些改變可能就是糖尿病角膜病變的角膜損害基礎(chǔ);在造模后6個月糖尿病病程中發(fā)生角膜潰瘍側(cè)角膜結(jié)構(gòu)靠近潰瘍區(qū)水腫增厚明顯，上皮細胞缺損嚴(yán)重。通過正常小鼠和造模后3個月、6個月糖尿病小鼠角膜病變的對比觀察，可以明顯發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠角膜病變的漸進性過程。通過對糖尿病小鼠角膜病變過程和潰瘍發(fā)生過程的形態(tài)學(xué)觀察，了解糖尿病小鼠病程中角膜的階段性損害特點，為在后期研究中探討糖尿病角膜病變保護因子在各個損害病程中作用和變化，提供了部分形態(tài)學(xué)研究基礎(chǔ)。

1 Schultz RO，Van Horn DL，Peters MA，Klewin KM，Schutten WH.Diabetic keratopathy［J］.Trans Am Ophthalmol Soc，1981，79(2):180-199.

2 Lutty GA.Effects of diabetes on the eye［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2013，54(14):81-87.

3 Nagai N，Ito Y.Therapeutic effects of sericin on diabetic keratopathy in Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty rats［J］.World J Diabetes，2013，4(6):282-289.

4 Yu FS，Yin J，Xu K，Huang J.Growth factors and corneal epithelial wound healing［J］.Brain Res Bull，2010，81(2-3):229-235.

5 Abdelkader H，Patel DV，McGhee CN，Alany RG.New therapeutic approaches in the treatment of diabetic keratopathy:a review［J］.Clin Experiment Ophthalmol，2011，39(3):259-270.

6 Bettahi I，Sun H，Gao N，Wang F，Mi X，Chen W，et al.Genome-wide transcriptional analysis of differentially expressed genes in diabetic，healing corneal epithelial cells:hyperglycemia-suppressed TGFβ3 expression contributes to the delay of epithelial wound healing in diabetic corneas［J］.Diabetes，2014，63(2):715-727.

7 金勇，朱勇，吳南翔.實驗性鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大、小鼠糖尿病動物模型研究進展［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(3):80-82.

8 Elena M，Ottavio G.Proposal open for discussion:defining agreed diagnostic procedures in experimental diabetes research［J］.J Ethnopharmacolo，2008，115(2):163-172.

9 Taylor HR，Kimsey RA.Corneal epithelial basement membrane changes in diabetes［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1981，20(4):548-553.

10 Schultz RO，Matsuda M，Yee RW，Edelhauser HF，Schultz KJ.Corneal endothelial changes in type I and type II diabetes mellitus［J］.Am J Ophthalmol，1984，98(4):401-410.