陳昌明，劉慧芳，曹雪姣，李新莉，辛毅，張翠麗（大連醫(yī)科大學生物技術系，遼寧 大連 116044）

姜黃素（Curcumin）是從姜科姜黃屬植物姜黃（Curcuma longa）根莖中提取的一種酚性色素，具有抗炎、抗氧化、降脂、抗病毒、清除自由基的作用[1-2]，同時還可抑制小鼠肉瘤S180、人大腸癌細胞HT29、腎癌細胞293、肝癌細胞HepG2細胞生長[3-5]。有文獻報道，姜黃素可抑制酪氨酸蛋白激酶（PTK）活性，從而抑制腫瘤細胞增殖，并通過阻斷細胞信號傳導途徑促發(fā)細胞凋亡[6]。本研究通過姜黃素對人宮頸癌Hela細胞的增殖抑制、促凋亡和細胞周期各時相的變化以及抑癌基因p53蛋白的表達影響的研究，為姜黃素的抗癌研究和應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

E100型倒置相差顯微鏡[尼康儀器（上海）有限公司]；CO2孵箱、MK3型酶標儀（美國Thermo公司）；FC500型流式細胞儀（美國Beckman公司）。

1.2 藥材

姜黃于2012年4月購于大連中藥店，經(jīng)大連醫(yī)科大學生物技術系李新莉講師鑒定為真品。

1.3 藥品與試劑

姜黃素對照品（天津一方科技有限公司，批號:20121259，純度:≥98%）；MTT（美國Amresco公司）；抗體β-actin、p53、HRP辣根過氧化物酶（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.4 細胞

人宮頸癌Hela細胞株由大連醫(yī)科大學生物技術系實驗室提供。

2 方法

2.1 姜黃素的提取

姜黃置50Ⅸ恒溫干燥箱過夜，粉碎過200目篩網(wǎng)。姜黃粉末按1∶10（m/V）加入70%乙醇浸提48h，抽濾浸提液，旋蒸，等分提取物分別以酸堿法和萃取法提純，計算得率[7]。姜黃提取液置－20Ⅸ貯藏，備用。

2.2 姜黃提取液質量濃度的測定

準確稱取20mg姜黃素對照品，加入200μl甲醇溶解得姜黃素對照品溶液（100mg/ml）。定量移取姜黃素對照品溶液（100mg/ml）適量，甲醇逐級10倍稀釋至0.1mg/ml；分別取0.1mg/ml的姜黃素對照品溶液10、20、30、40、50、60μl與姜黃提取液30μl（甲醇溶解，質量濃度為0.1mg/ml），均設3復孔，以甲醇定容至200μl量瓶中，檢測420nm波長處的光密度（OD）[8]。分別以姜黃素濃度（c）為橫坐標，OD為縱坐標，進行線性回歸，計算姜黃提取液的質量濃度。

2.3 細胞增殖抑制實驗[6]

取1.0×105ml－1的對數(shù)生長期Hela細胞，接種于96孔板（200μl/孔）。至細胞貼壁，每孔加入200μl姜黃提取液（以0.05mg/ml為單位添加，自0.05mg/ml至0.50mg/ml計10個質量濃度，各質量濃度設3個平行孔）；以同體積1640培養(yǎng)液為空白對照；以只加姜黃提取液的甲醇溶液為陰性對照（200μl/孔，3復孔）。酶標儀檢測589nm波長處的OD，計算細胞增殖抑制率。抑制率＝（空白對照組OD－用藥組OD）/空白對照組OD×100%。

2.4 形態(tài)學觀察

取對數(shù)生長期的Hela細胞，加入終質量濃度為0.02、0.06、0.10mg/ml的姜素提取液3ml，培養(yǎng)24h，以倒置顯微鏡觀察Hela細胞形態(tài)學變化。

2.5 Hela細胞總蛋白含量的測定[7-8]

取分別加入0.05、0.25mg/ml的姜黃提取液（藥物組）以及常規(guī)1640培養(yǎng)液（空白對照）培養(yǎng)24h的Hela細胞，以0.25%胰蛋白酶消化，4Ⅸ下，以離心半徑為8 cm、4000 r/min離心6min，加1ml PBS（pH7.2）沉淀，移入1.5ml離心管中，再次離心棄上清。向離心管中加入200μl細胞裂解液[苯甲基磺酰氟（PMSF）10μl/ml]，冰上反復吹吸10min，4Ⅸ下，以離心半徑為8 cm、12000 r/min離心10min，取上清，以小牛血清白蛋白（BSA）為標準品檢測蛋白質含量，－20Ⅸ貯藏，備用。

2.6 Western blot檢測p53蛋白

常規(guī)SDS-PAGE凝膠電泳（5%的濃縮膠，10%的分離膠，蛋白質上樣量60μg，30 mA恒流，待溴酚藍至膠底端1 cm時停止電泳）；依據(jù)蛋白Marker切取凝膠（含目的蛋白）及等尺寸的濾紙、硝酸纖維素薄膜（NC膜），半干式電轉儀轉膜45～55min；取NC膜，以TBST清洗2～3次，5min/次，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗NC膜10min/次（2～3次）后，轉入1∶500稀釋的一抗（β-actin、p53）中，4Ⅸ過夜；TBST清洗NC膜3次（10min/次），HRP辣根過氧化物酶（二抗，稀釋倍數(shù)1∶5000，V/V）室溫孵育1 h，TBST洗滌（10min/次，2～3次），加入 ECL發(fā)光試劑，全自動凝膠成像儀成像（每5s成像1次，成像300s），Quantity One分析軟件分析[9]。

2.7 流式細胞儀測定Hela細胞的凋亡

0.02、0.06、0.10mg/ml的姜黃提取液作用于Hela細胞24h，消化、收集細胞，PBS清洗，用于凋亡和周期（70%冷乙醇固定，過200目網(wǎng)，調整細胞數(shù)為1×106ml－1）各時相變化的檢測[10]。

3 結果

3.1 姜黃素提取率計算結果

40 g姜黃粗提物，經(jīng)酸堿法純化得姜黃素0.3696 g，萃取法得0.6664 g。提取率依次為0.924%和1.666%，萃取法提純是酸堿法的1.8倍，因此選擇萃取法提取。

3.2 姜黃素含量計算結果

回歸方程為A＝423.71 c－0.0566（r2＝0.9907），姜黃提取液中姜黃素含量為58.34%。

3.3 姜黃素對Hela細胞增殖的抑制作用

姜黃提取液質量濃度為0.2mg/ml（含姜黃素116.68μg/ml）時其抑制率達到峰值63.20%，半數(shù)抑制質量濃度（IC50）為0.33mg/ml（含姜黃素 192.52μg/ml），且抑制率在 0.05～0.2mg/ml質量濃度范圍內隨質量濃度增高而增大（P＜0.01）。姜黃素對Hela細胞增殖的抑制作用見表1。

表1 姜黃素對Hela細胞增殖的抑制作用（，n＝3）Tab 1 Inhibitory effects of different concentrations of curcumin on the growth of Hela cells in 24h（，n＝3）

表1 姜黃素對Hela細胞增殖的抑制作用（，n＝3）Tab 1 Inhibitory effects of different concentrations of curcumin on the growth of Hela cells in 24h（，n＝3）

姜黃素提取液質量濃度，mg/ml 0.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50姜黃素質量濃度，μg/ml 29.1758.3487.51116.68145.85175.02204.19233.36262.53291.7 O D 0.437±0.0310.314±0.0310.205±0.0130.170±0.0080.210±0.0080.256±0.0210.257±0.0180.268±0.0130.277±0.0140.286±0.086抑制率，%15.3437.3156.9063.2056.0047.7947.7345.6444.0242.46

3.4 姜黃素對Hela細胞形態(tài)學的影響

加入0.02mg/ml（含姜黃素11.67μg/ml）、0.06mg/ml（含姜黃素35.00μg/ml）、0.10mg/ml（含姜黃素58.34μg/ml）姜黃提取液培養(yǎng)24h的Hela細胞，其細胞數(shù)目明顯少于空白對照，且細胞變圓、縮小、老化，核質發(fā)散，并隨濃度的升高，凋亡明顯。Hela細胞的形態(tài)學見圖1。

圖1 Hela細胞的形態(tài)學A.空白對照組；B.0.02mg/ml姜黃提取液組；C.0.06mg/ml姜黃提取液組；D.0.10mg/ml姜黃提取液組Fig 1 Morphology of Hela cellsA.blank control group；B.0.02mg/ml C.longa extract；C.0.06mg/mlC.longa extract；D.0.10mg/mlC.longa extract

3.5 姜黃素對Hela細胞p53蛋白表達的影響

質量濃度為0.05mg/ml（含姜黃素29.17μg/ml）、0.25mg/ml（含姜黃素145.85μg/ml）時姜黃提取液作用Hela細胞24h，p53蛋白的表達與空白對照比較明顯增強。Hela細胞p53蛋白的表達見圖2（圖中0mg/ml為空白對照）。

圖2 Hela細胞p53蛋白的表達Fig 2 The expression of p53protein in Hela cells

3.6 姜黃素對Hela細胞凋亡的影響

姜黃提取液處理24h后，早期凋亡細胞所占的百分比由0.74%增加到1.43%，晚期凋亡細胞由2.45%增加到96.50%，即姜黃素誘導Hela細胞的死亡性質為凋亡，且其作用具有明顯劑量依賴性。Hela細胞凋亡見圖3。

圖3 Hela細胞凋亡A.空白對照組；B.0.02mg/ml姜黃提取液組；C.0.06mg/ml姜黃提取液組；D.0.10mg/ml姜黃提取液組Fig 3 The apoptosis of Hela cellsA.blank control group；B.0.02mg/ml C.longa extract；C.0.06mg/mlC.longa extract；D.0.10mg/mlC.longa extract

3.7 姜黃素對Hela細胞周期的影響

不同質量濃度姜黃提取液（姜黃素質量濃度同“3.4”項下）處理24h后，G2/M期細胞比例由5.02%增至16.96%，同時G0/G1期與S期細胞比例減少，提示姜黃素使Hela細胞周期阻滯在G2/M期，從而抑制細胞增殖。Hela細胞周期分布見表2（表中0mg/ml為空白對照）。

表2 Hela細胞周期分布Tab 2 The cycle distribution of Hela cells

4 討論

宮頸癌現(xiàn)已成為危害女性健康的第二殺手。我國每年新發(fā)病例14萬，占婦女生殖道惡性腫瘤的第1位[11-12]。細胞凋亡始終是腫瘤的分子生物學研究熱點[13]。p53蛋白表達與宮頸癌的發(fā)生有關[14-15]，且在細胞周期調控、細胞凋亡誘導等過程中發(fā)揮重要作用。本文以Hela細胞為研究對象，探討姜黃素對Hela細胞生長、凋亡及p53蛋白表達的影響。結果表明，姜黃素對Hela細胞有較明顯的抑制作用，在116.68μg/ml附近出現(xiàn)抑制率峰值，在一定質量濃度范圍內，姜黃素作用Hela細胞24h，p53蛋白表達隨質量濃度增加而增強；細胞流式儀檢測細胞凋亡數(shù)目相對增多；姜黃素對Hela細胞G2期有阻滯，從而使G1期和S期細胞相對減少，G2/M期細胞相對增多，即對Hela細胞G2/M期有明顯的阻滯作用，使細胞凋亡率增高。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細胞凋亡有關，誘導細胞凋亡已成為腫瘤治療的熱點，亦成為評估抗癌藥物作用能力的重要指標。由于姜黃素對腫瘤細胞的作用并非針對單一靶點，具有廣泛的生物學作用，因此對姜黃素誘導Hela細胞凋亡機制的進一步研究以及阻滯細胞傳導通路、信使的相關研究，將對其臨床應用具有良好的指導意義。

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