劉麗雅，韓永龍，余奇，朱金輝，郭澄1，#（1.上海中醫(yī)藥大學，上海0103；.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院藥劑科，上海 0033）

中藥注射劑是國內(nèi)獨創(chuàng)的，以中醫(yī)藥理論為指導，采用現(xiàn)代科技從單方或復方中藥材中提取有效物質(zhì)制成的可供注入人體內(nèi)的制劑。由于其療效獨特，在臨床上廣泛應(yīng)用。目前，獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準的中藥注射劑有121種、866個批準文號。這些中藥注射劑在臨床經(jīng)常與化學藥聯(lián)合使用，引起較多不良反應(yīng)。藥物相互作用（Drug drug interactions，DDI）引起的不良反應(yīng)日益受到關(guān)注，其中代謝性DDI發(fā)生率最高，約占40%[1]。細胞色素P450（CYP）被抑制或被誘導是導致藥物代謝性相互作用的主要原因，酶抑制作用約占代謝性相互作用的70%[2-3]。CYP主要存在于肝臟中，涉及藥物代謝的主要有CYP1、CYP2、CYP3家族中7種重要的亞型，包括CYP1 A2（占CYP代謝藥物的8.9%）、CYP2 B6（7.2%）、CYP2 C8（4.7%）、CYP2 C9（12.8%）、CYP2 C19（6.8%）、CYP2 D6（20%）與CYP3 A4/5（30.2%）[3]，美國食品藥物管理局在其2012版《藥物相互作用研究指南草案》中也重點關(guān)注了這7個亞型。

目前，研究中成藥對CYP作用的報道中，大多使用大鼠、小鼠或家兔作為體內(nèi)、外實驗對象，由于CYP活性存在較大的種屬差異，其研究結(jié)果往往不能準確反映對人的影響。筆者研究的丹紅注射液等10種心血管類中藥注射劑是臨床中使用量較大、存在多藥聯(lián)用現(xiàn)象的藥物，通過研究它們對人肝微粒體中上述7種主要的CYP亞型的體外抑制作用，可以為臨床合理用藥提供參考，避免代謝性藥物相互作用的發(fā)生。

1 材料

1.1 儀器

Agilent QQQ液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括G6410 B型三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜、G1311 A型四元輸液泵、G1322 A型脫氣機、G1367 B型自動進樣器、G1316 A型柱溫箱，配有電噴霧源和MassHunter軟件工作站（美國Agilent公司）；BP211 D型電子天平（德國Sartorius公司）；BR 4 i型高速冷凍離心機（法國Jouan公司）；Vortex Genie 2型渦旋混懸器（美國Vortex公司）；MDF-U32 V型超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；Q型純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；DKZ-1型電熱恒溫振蕩水槽（上海一恒科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

丹紅注射液（DH，菏澤步長制藥有限公司，批號:12091003）；紅花注射液（HH，太原華衛(wèi)藥業(yè)有限公司，批號:11102701）；丹參注射液（DS，上海中西制藥有限公司，批號:130307）；注射用丹參多酚酸鹽（DSDF，上海綠谷制藥有限公司，批號:12120221）；燈盞細辛注射液（DZXX，云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司，批號:20121235）；注射用燈盞花素（DZHS，昆明龍津藥業(yè)股份有限公司，批號:20120918-1）；參麥注射液（SM，正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號:1207115）；參附注射液（SF，雅安三九藥業(yè)有限公司，批號:120802）；舒血寧注射液（SXN，神威藥業(yè)集團有限公司，批號:130204 A2）；疏血通注射液（SXT，牡丹江友搏藥業(yè)有限公司，批號:2012042521）；對乙酰氨基酚（批號:100018-200408）、雙氯芬酸（批號:100334-200302）、咪達唑侖（批號:171250-200401）、槲皮素（批號:100081-200907）、噻氯匹定（批號:100542-200301）、酮康唑（批號:100294-200602）、維拉帕米（批號:100223-300102）均購自中國食品藥品檢定研究院；氧化型輔酶Ⅸ（NADP）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH）、葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）、4-羥基美芬妥英、右啡烷、非那西丁、右美沙芬、呋拉茶堿、塞替派、磺胺苯吡唑均購于美國Sigma公司；去甲阿莫地喹、阿莫地喹、s-美芬妥英均購自加拿大TRC公司；羥基安非他酮（美國Cerilliant公司）；4-羥基雙氯芬酸（美國TLC公司）；1-羥基咪達唑侖（美國IL公司）；安非他酮（日本TCI公司）；奎尼?。ㄖ袊凫`威科技有限公司）；其余無機鹽均為分析純，有機溶劑均為色譜純，水為超純水。

1.3 微粒體

混合人肝微粒體（上海瑞德肝臟疾病研究有限公司）。

2 方法

2.1 待測藥物溶液的制備[4]

10種心血管類中藥注射劑除DSDF 200mg和DZHS 50mg分別用10ml的0.9%NaCl溶解作為貯備液外，其余都以原液作為貯備液，用pH7.4的100mmol/L PBS逐步稀釋至9個不同濃度的工作液。DSDF的質(zhì)量濃度范圍為2～4000μg/ml；DZHS的質(zhì)量濃度范圍為0.5～1000μg/ml；DH、HH和DZXX的體積分數(shù)范圍為0.001%～1.6%；DS與SXT的體積分數(shù)范圍為0.01%～20%；SM、SF和SXN的體積分數(shù)范圍為0.015%～30%。

2.2 體外人肝微粒體孵育體系

終體積為250μl的體外孵育體系包括混合人肝微粒體蛋白（0.25mg/ml）、MgCl2（5mmol/L）、G-6-PDH（1u/ml）、G-6-P（5mmol/L）、PBS（100mmol/L）、混合探針底物（非那西丁、安非他酮、阿莫地喹、雙氯芬酸、s-美芬妥英、右美沙芬、咪達唑侖終濃度分別為20、30、0.1、1、40、2、2 μmol/L）和不同質(zhì)量濃度的待測藥物或陽性抑制劑，在37Ⅸ水浴中預孵化5min后加入尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+，1mmol/L）啟動反應(yīng)，孵化10min，整個孵育體系控制有機溶劑的體積分數(shù)在1%以內(nèi)。用25μl含內(nèi)標維拉帕米的終止液[H2O∶CH3CN∶HCOOH＝42∶55∶3（V/V/V）][5]在冰上終止反應(yīng)，然后渦旋混合30 s后，4Ⅸ下、20000×g離心15min，取上清液20μl進樣。生成相應(yīng)的7種代謝產(chǎn)物對乙酰氨基酚、羥基安非他酮、去阿莫地喹、4-羥基雙氯芬酸、4-羥基美芬妥英、右啡烷、1-羥基咪達唑侖，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）定量分析。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件[5]

2.3.1 色譜條件色譜柱:Agilent XDBC18（50mm×2.1mm，3.5μm）；流動相A:水（0.1%甲酸），流動相B:乙腈（0.1%甲酸），采用梯度洗脫[0→4.0min，5%→80%（B）；4.0→4.2min，80%（B）；4.2→6.0min，80%→5%（B）]；流速:0.3ml/min ；柱溫:40Ⅸ。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源:ESI源；掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；噴霧電壓:4kV；噴霧起壓:40psi；霧化器溫度:350Ⅸ；氣流速度:11 L/min。7個探針藥物代謝產(chǎn)物及內(nèi)標的MRM質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 7個探針藥物代謝產(chǎn)物及內(nèi)標的MRM質(zhì)譜參數(shù)Tab 1 Multiple reaction response monitoring spectrum parameters of 7probe substrates and internal standard

2.4 陽性抑制劑半數(shù)抑制濃度（IC50）測定

將7個不同濃度的陽性抑制劑[呋拉茶堿（0.0192～19.2μmol/L）、塞替派（0.528～528μmol/L）、槲皮素（0.015～15μmol/L）、磺胺苯吡唑（0.0075～7.5μmol/L）、噻氯匹定（0.0176～17.6μmol/L）、奎尼?。?.0008～0.75μmol/L）和酮康唑（0.0003～0.3 μmol/L）]分別與“2.2”項下混合底物共同孵化，對照加入等體積100mmol/L PBS代替，每個樣品平行操作3次，余下孵育處理程序同”2.2”項下方法，測定同”2.3”項下方法。使用GraphPad Prism v5.0軟件按照非線性回歸，作圖并計算IC50。

2.5 10種心血管類中藥注射劑半數(shù)抑制體積分數(shù)/質(zhì)量濃度（IC50）的測定

取“2.1”項下10種心血管類中藥注射劑9個不同質(zhì)量濃度的工作液，逐個與“2.2”項下混合底物及體外人肝微粒體孵育體系共同孵化，對照加入等體積100mmol/L的PBS代替，每個樣品平行操作3次，余下孵育處理程序同“2.2”項下方法，測定同“2.3”項下方法。使用GraphPad Prism v5.0軟件按照非線性回歸，作圖并計算IC50。

3 結(jié)果

3.1 陽性抑制劑對CYP7個亞型活性的抑制作用

為評價方法的合理性，在測定藥物對CYP 7個亞型抑制作用的同時也測定了陽性抑制劑的抑制作用。結(jié)果表明，CYP1 A2、CYP2 B6、CYP2 C8、CYP2 C9、CYP2 C19、CYP2 D6和CYP3 A4/5的陽性抑制劑呋拉茶堿、塞替派、槲皮素、磺胺苯吡唑、噻氯匹定、奎尼丁和酮康唑?qū)ο鄳?yīng)酶型均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。陽性抑制劑的IC50見表2。

表2 陽性抑制劑的IC50Tab 2 IC50of positive inhibitors

3.2 10種心血管類中藥注射劑對CYP7個亞型活性的抑制作用

10種心血管類中藥注射劑中DH對7種CYP均有明顯抑制作用，其中對CYP2 C8的抑制作用最強，其次依次是CYP1 A2、CYP3 A4/5、CYP2 B6、CYP2 D6、CYP2 C19和CYP2 C9；HH對CYP2 C8有明顯抑制作用；其余8種中藥注射劑對CYP各亞型活性無明顯抑制作用（IC50均大于日用藥量）或無抑制作用。DH對CYP7種亞型與HH對CYP2 C8的體外抑制效果見圖1；心血管類中藥注射劑IC50見表3。

4 討論

Cocktail探針藥物法主要用于評價藥物對CYP活性的影響，該方法可以使多個代謝途徑的信息綜合反映在單個實驗過程當中，明顯地縮短分析周期，提高分析效率，節(jié)省人力物力，更重要的是這種方法可以減少個體間差異對研究結(jié)果的影響[9]。本研究中選用的7種CYP的已知特異性抑制劑，分別與混合探針底物共同孵化，計算得到的IC50與文獻[6-8]報道值具有較好的一致性，表明筆者建立的Cocktail探針藥物法可以用于研究藥物對CYP 7種亞型的體外抑制作用。

圖1 DH對CYP7種亞型與HH對CYP2 C8的體外抑制效果A～G.DH對CYP7種亞型的體外抑制效果；H.HH對CYP2 C8的體外抑制效果Fig 1 Inhibitory effects of Danhong injection on 7 subtypes of human CYPand that of Honghua injection on CYP2 C8A～G.Inhibitory effects of Danhong injection on 7subtypes of human CYP；H.Innhibitory effects of Honghua injection on CYP2 C8

在預試驗中，筆者采用10種心血管類中藥注射劑的日用藥量研究了對CYP各亞型的抑制作用，結(jié)果顯示不同中藥注射劑對CYP活性影響差異大，同一種中藥注射劑對7種CYP亞型活性影響也不盡相同，若選用統(tǒng)一的體積分數(shù)/質(zhì)量濃度范圍進行測定，將會影響IC50的計算。因此根據(jù)上述抑制作用結(jié)果，針對每種中藥注射劑篩選出不同的體積分數(shù)/質(zhì)量濃度范圍進行測定。文獻[4，10]采用在體外微粒體孵育體系中直接加入不同體積比的注射劑評估其對CYP各亞型的影響，并計算出相應(yīng)的IC50（以加入中藥注射劑原液體積占孵育體系的總體積的體積分數(shù)表示）。筆者采用此法計算出了8種心血管類中藥注射劑對CYP 7個亞型的IC50。另外2種注射劑，DSDF和DZHS用適當溶媒稀釋后作為注射液進行上述測定，最后經(jīng)換算以μg/ml表示IC50。表3中的日用藥體積分數(shù)/質(zhì)量濃度為這些心血管類中藥注射劑說明書中規(guī)定的臨床每日用藥劑量與人體中血液5 L的比值，DH對7種CYP的IC50范圍為0.09%～0.98%，均低于日用體積分數(shù)1.6%。提示在正常劑量下，DH對CYP1 A2、CYP2 B6、CYP2 C8、CYP2 C9、CYP2 C19、CYP2 D6和CYP3 A4/5均可能有抑制作用。余小翠等[11]研究表明，DH對大鼠肝微粒體CYP1 A2活性有抑制作用，其IC50為0.54%且為混合型抑制，對CYP2 C9有弱抑制作用，對CYP2 D6、CYP2 E1、CYP3 A4活性無明顯影響。本研究中DH對CYP1 A2的IC50為0.49%，結(jié)果與上述文獻相近。大鼠與人共有的CYP亞型僅有CYP1 A2與CYP2 E1[12]，Turpeinen M等[13]的體外肝微粒體研究結(jié)果表明，與人CYP1 A2、CYP3 A活性相關(guān)性好的動物模型分別為大鼠和小鼠，這可能是導致丹紅注射液對CYP2 C9、CYP2 D6和CYP3 A4/5結(jié)果與文獻[11]差異的原因，最終還需臨床試驗進一步驗證。

表3 心血管類中藥注射劑IC50Tab 3 IC50of cardiovascular TCM injections

研究表明，臨床近90%的化學藥物經(jīng)由CYP1 A2、CYP2 B6、CYP2 C8、CYP2 C9、CYP2 C19、CYP2 D6和CYP3 A4/5這7種CYP亞型代謝[3]，因此此類化學藥物聯(lián)合使用DH或HH時需謹慎，以避免產(chǎn)生代謝性藥物相互作用導致的藥物不良反應(yīng)。

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