羅輝燕，馮冬冬，于偉娜，丁陳波，李靜，馮繼紅#（.重慶市第三人民醫(yī)院腫瘤科，重慶 40004；.壽縣中醫(yī)院心內(nèi)科，安徽 壽縣 00；.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院，貴州 遵義 5600）

結(jié)直腸癌（Colorectal carcinoma，CRC）是常見(jiàn)消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。全球范圍內(nèi)，CRC分別位居男、女性惡性腫瘤的第三、四位，導(dǎo)致每年61萬(wàn)人死亡[1-2]。在中國(guó)，近年CRC發(fā)病率逐年上升，且發(fā)病年齡提前，每年約有40萬(wàn)新增病例，目前在我國(guó)消化系統(tǒng)惡性腫瘤中列第二位[3]。

槲皮素是黃酮類化合物重要的一員，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素及其衍生物可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，具有較為廣闊的應(yīng)用前景。槲皮素具有明確的抗腫瘤作用，對(duì)乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等都具有預(yù)防作用和一定的治療作用[4]。槲皮素抗腫瘤作用涉及多種機(jī)制，但對(duì)結(jié)直腸癌的作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在通過(guò)觀察槲皮素對(duì)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)其B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、癌基因C-myc表達(dá)的影響，探討其抗腫瘤作用機(jī)制，為槲皮素在結(jié)直腸癌化療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

CKX31型顯微鏡（日本Olympus公司）；CJ-2 F型超凈工作臺(tái)（蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司）；MCO175型CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；Spectra Mr型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Dynex公司）；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀、垂直電泳槽、凝膠成像分析儀（美國(guó)Bio-Rad公司）

1.2 試劑

L-15培養(yǎng)基（Leibovitz’s L-15 Medium，美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（FBS，美國(guó)Hyclone公司）；兔抗人Bcl-2單抗、兔抗人C-myc單抗（美國(guó)Epitomics公司）；兔抗人β-actin單抗（北京中衫金橋公司）；槲皮素（純度≥98.5%）、MTT、二甲亞楓（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Trizol、實(shí)時(shí)熒光定量反相（qRT）PCR（qRT-PCR）試劑盒、Premix Taq酶、Marker均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；凱基全蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜、瓊脂糖（Agarose）、TAE（50×）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光試劑盒（美國(guó)Millipore公司）。

1.3 細(xì)胞

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SW480細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的L-15培養(yǎng)基中，在5%的CO2飽和濕度、37Ⅸ恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。SW480細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，每2～3 d用0.25%胰酶消化，以1∶2傳代。SW480細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于試驗(yàn)。

2.2 藥物處理與分組

槲皮素用DMSO制備成貯備液，－20Ⅸ貯藏，備用。試驗(yàn)時(shí)用L-15培養(yǎng)基稀釋，DMSO的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜0.1%。試驗(yàn)分3大組，即空白對(duì)照（200μl L-15培養(yǎng)液）組、溶劑對(duì)照（200μl L-15培養(yǎng)液+150μl DMSO）組、試驗(yàn)（200μl L-15培養(yǎng)基+不同梯度濃度的槲皮素，槲皮素的終濃度分別為5、10、20、40、80、160 μmol/L）組。

2.3 MTT法檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞懸液，以每孔3×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加含10%FBS的L-15培養(yǎng)液200μl，于37Ⅸ、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁后按“2.2”項(xiàng)下方法給藥。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h，每一濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，于各時(shí)間段前4h每孔避光加入MTT（5g/L，PBS稀釋）20μl，培養(yǎng)終止后棄上清加入DMSO 150μl/孔，振蕩溶解10min，待結(jié)晶完全溶解后于酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各個(gè)濃度的光密度（OD），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（IR）＝[1－（試驗(yàn)組OD－溶劑對(duì)照組OD）/（空白對(duì)照組OD－溶劑對(duì)照組OD）]×100%。

2.4 qRT-PCR檢測(cè)SW480細(xì)胞中Bcl-2、C-myc mRNA的表達(dá)

Bcl-2引物序列 ，上 游 :5′-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3′，下游:5′-ATCCCAGCCTCCGTTATCC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為137bp；C-myc引物序列，上游:5′-CGAGGAGGAGAACTTCTACCAGC-3′，下 游:5′-CGAGAAGCCGCTCCACATACAGTCC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為471bp；β-actin引物序列，上游:5′-ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3′，下游:5′-TGGGTCATCTTCTCGCGGTTGG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 417 bp。分別培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72h后，收集細(xì)胞，Trizol法提取RNA，鑒定完RNA純度和完整性后，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA；PCR反應(yīng)條件為:95Ⅸ預(yù)變性lmin；95Ⅸ變性15 s，58Ⅸ退火20 s，72Ⅸ延伸20 s，循環(huán)40次；72Ⅸ延伸5min終止反應(yīng)。qRTPCR反應(yīng)結(jié)束后，定量分析PCR獲得的熔解曲線和擴(kuò)增曲線結(jié)果的可靠性并設(shè)定循環(huán)閾值（Ct），以Bcl-2/β-actin、C-myc/β-actin比值分別代表各自相對(duì)表達(dá)水平，計(jì)算Bcl-2、C-myc mRNA的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 Western blot法檢測(cè)SW480細(xì)胞中Bcl-2、C-myc蛋白的表達(dá)

分組收集用藥物干預(yù)SW480細(xì)胞48 h后的細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液，冰浴30min，高速離心后取上清采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整到標(biāo)準(zhǔn)濃度后分別取50μl樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%的脫脂奶粉封閉1 h，分別加一抗稀釋液（兔抗人單抗）4Ⅸ孵育過(guò)夜，再用辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗37Ⅸ孵育1 h。PBST緩沖液洗膜10min×3次。ECL熒光顯色后在暗室中進(jìn)行X片曝光，結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)分析拍照并對(duì)凝膠條帶的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，以Bcl-2/β-actin、C-myc/β-actin的比值作為各自蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 槲皮素對(duì)SW480細(xì)胞增殖的抑制作用

不同濃度的槲皮素對(duì)SW480細(xì)胞增殖有明顯抑制作用。由于OD可間接反映活細(xì)胞的數(shù)目，槲皮素濃度范圍為20～160 μmol/L時(shí)，隨著槲皮素濃度的增加，SW480細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD均降低，說(shuō)明抑制率呈上升趨勢(shì)，顯示抑制作用呈劑量依賴關(guān)系。槲皮素在作用不同時(shí)間時(shí)對(duì)SW480細(xì)胞增殖抑制有不同作用，當(dāng)槲皮素濃度＜20 μmol/L時(shí)，與溶劑對(duì)照組比較，作用24、48、72h后的抑制率均無(wú)明顯變化（P＞0.05），但都起到一定抑制作用；當(dāng)槲皮素濃度在20～160 μmol/L時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)SW480細(xì)胞增殖的抑制明顯增強(qiáng)（P＜0.05），顯示抑制作用呈時(shí)間依賴關(guān)系。槲皮素對(duì)SW480細(xì)胞增殖的抑制作用見(jiàn)圖1。

圖1 槲皮素對(duì)SW480細(xì)胞增殖的抑制作用Fig 1 Inhibition of quercetin on the proliferation SW480 cells

3.2 槲皮素（40μmol/L）作用SW480細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)Bcl-2、C-myc mRNA表達(dá)的影響

槲皮素（40 μmol/L）作用SW480細(xì)胞0、24、48、72h后，與溶劑對(duì)照組比較，試驗(yàn)組SW480細(xì)胞Bcl-2、C-myc mRNA表達(dá)強(qiáng)度隨槲皮素作用時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Bcl-2、C-myc mRNA的表達(dá)見(jiàn)圖2。

3.3 槲皮素（40μmol/L）作用SW480細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)Bcl-2、C-myc蛋白表達(dá)的影響

圖2 Bcl-2、C-myc mRNA的表達(dá)Fig 2 mRNAexpression of Bcl-2and C-myc

槲皮素（40μmol/L）作用SW480細(xì)胞48、72h后，與溶劑對(duì)照組比較，試驗(yàn)組Bcl-2、C-myc蛋白表達(dá)強(qiáng)度隨槲皮素作用時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Bcl-2、C-myc蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖3。

圖3 Bcl-2、C-myc蛋白的表達(dá)Fig 3 Protein expression of Bcl-2and C-myc

4 討論

CRC是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在我國(guó)呈逐年上升趨勢(shì)。肝轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因，盡管國(guó)內(nèi)外有關(guān)CRC轉(zhuǎn)移已有很多研究，但仍無(wú)解決臨床實(shí)際問(wèn)題的成果[4]。目前CRC的治療以綜合治療為主，多采用中藥聯(lián)合化療、放療和手術(shù)。中藥及其有效成分的對(duì)CRC作用的研究越來(lái)越深入，部分已應(yīng)用到臨床，并取得了一定的效果[5-6]。

已有多項(xiàng)研究表明，槲皮素對(duì)多種惡性腫瘤如胃癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、膽囊癌等均有抑制其生長(zhǎng)的作用，并可促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡[7]。槲皮素可通過(guò)多途徑來(lái)發(fā)揮抗腫瘤效果、抑制多種腫瘤細(xì)胞的分裂增殖，通過(guò)多種途徑促進(jìn)其凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲，降低其耐藥性，在臨床抗腫瘤治療中，發(fā)揮著重要作用[8]。近年研究結(jié)果表明，槲皮素可抑制SW480、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2等CRC細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡[9-11]。本研究結(jié)果表明，不同濃度的槲皮素對(duì)SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖有明顯抑制作用，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。由此可見(jiàn)，槲皮素在體外對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，且能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

為闡明槲皮素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制，筆者進(jìn)一步研究了SW480細(xì)胞中Bcl-2和C-myc mRNA和蛋白表達(dá)的變化，且二者的表達(dá)隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而減弱。已知Bcl-2是抗凋亡基因，可穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜系統(tǒng)、抑制線粒體內(nèi)離子及細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制凋亡的發(fā)生；能抑制許多抗腫瘤藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低其細(xì)胞毒性；還可與其他癌基因如C-myc和抗癌基因p53相互作用，間接地調(diào)控細(xì)胞程序性死亡[12]。C-myc癌基因具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的雙重作用。槲皮素是否通過(guò)抗凋亡基因Bcl-2作用于C-myc導(dǎo)致其表達(dá)變化尚不得而知，其關(guān)聯(lián)調(diào)節(jié)作用尚需證實(shí)。綜上所述，一定濃度的槲皮素在體外能誘導(dǎo)SW480細(xì)胞中Bcl-2和C-myc的表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明槲皮素可能通過(guò)Bcl-2和c-myc基因?qū)?xì)胞增殖起抑制作用并誘導(dǎo)其凋亡，具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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