于丁一，趙春苗，楊 揚(yáng)，程小剛，仇 珺，王 聰，田 宇，余 擎

(陜西:1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710032;2.市口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，寶雞 721001)

在根管治療的過程中，常見到少數(shù)病例雖然接受了徹底地根管治療，但仍出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的根尖周炎癥。有研究認(rèn)為，引起根尖周組織反復(fù)感染的原因主要與根尖外生物膜有關(guān)［1］。感染根管內(nèi)的細(xì)菌不是單一菌種，而是由多菌種組成的混合感染;各菌種間通過相互共生，不僅能在根管壁上形成細(xì)菌生物膜，同時(shí)還可穿過根尖孔并在根管外根尖牙骨質(zhì)上形成生物膜［2］，從而導(dǎo)致尖周炎癥的反復(fù)發(fā)作。

在去除根管內(nèi)細(xì)菌生物膜方面，已有各種具有殺菌作用的根管沖洗液如:次氯酸鈉(NaClO)、強(qiáng)酸性電解質(zhì)水(SAEW)等用于臨床。其中應(yīng)用最多的是NaClO沖洗劑，該溶液不僅具有殺菌和溶解有機(jī)物質(zhì)的能力，還可破壞細(xì)菌生物膜的結(jié)構(gòu)［3］。SAEW是一種在日常生活中廣泛使用的殺菌劑之一，因其對細(xì)菌如大腸桿菌、腸球菌屬和病毒HIV等均具有良好的抑制或殺滅作用［4］，近年來也逐漸用于根管沖洗。

在去除根尖外細(xì)菌生物膜方面，目前最常用的方法是根尖外科手術(shù);而使用具有殺菌作用的沖洗劑去除根尖外生物膜的方法尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立根尖外多菌種生物膜體外模型，觀察比較不同根管沖洗劑對其的殺滅作用，以期為更好的去除根尖外生物膜提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

糞腸球菌(ATCC 29212，美國);血液鏈球菌(ATCC 10556，美國);衣氏放線菌 (ATCC 12103，美國);牛心腦浸液培養(yǎng)基(BHI，青島海博生物技術(shù)有限公司);強(qiáng)酸性電解質(zhì)水(Alfa Light;Amano Co.，Yokohama，日本);次氯酸鈉液(天津天力化學(xué)試劑有限公司);厭氧培養(yǎng)箱(Hypoxystation H85，Don Whitley Scientific Limited，英國);慢速切鋸(BUEHLER，美國);麥?zhǔn)媳葷醿x(PhoenixSpec Nephelometer，Becton Dickinson ＆ Company，美國);酶標(biāo)儀(Power Wave 340，BIO TEK，美國);掃描電鏡(S 一 4800，Hitachi，日本);Live/dead 熒光活死菌染色劑(LIVE/DEAD@BacLight Bacterial Viability Kit.L －13152，Molecular Probes;Invitrogen Inc.;Carls bad，CA);激光共聚焦顯微鏡(CLSM，F(xiàn)luo-View 1 000，OLYMPUS，日本)。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)和菌懸液制備

分別將糞腸球菌和血鏈球菌接種于BHI瓊脂平板，衣氏放線菌接種于血瓊脂平板，并劃線分離出單個(gè)菌落;然后將3種細(xì)菌放入37℃厭氧箱(920 mL/L N2、80 mL/L CO2)中進(jìn)行培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)12 h(糞腸球菌和血液鏈球菌)、24 h(衣氏放線菌)時(shí)，挑取各菌種單菌落轉(zhuǎn)種于BHI液體培養(yǎng)基，厭氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)。糞腸球菌和血液鏈球菌培養(yǎng)12 h后，衣氏放線菌培養(yǎng)48 h后，取各菌菌液用BHI液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋;并在麥?zhǔn)媳葷醿x上調(diào)整麥?zhǔn)现禐?.5(細(xì)菌濃度約為1×108cfu/mL)。

1.3 3種細(xì)菌相互作用實(shí)驗(yàn)

取上述稀釋好的衣氏放線菌菌懸液5 μL分別接種于1/2 BHI瓊脂平板和BHI瓊脂平板，37℃厭氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，緊挨放線菌菌落分別滴加血鏈球菌和糞腸球菌菌懸液各5 μL，再次厭氧培養(yǎng)12 h后，分別觀察兩種培養(yǎng)基中的菌落生長情況［5］。

1.4 3種細(xì)菌生物膜成膜觀察

取96孔板分別于每孔加入200 μL BHI培養(yǎng)液后，再于每孔中各滴入5 μL衣氏放線菌懸菌液，置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后先取3個(gè)孔用結(jié)晶紫染色法觀察單菌種生物膜成膜情況;其余各孔再分別滴入血鏈球菌和糞腸球菌菌懸液各5 μL，厭氧條件下共同培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后24、48、54、56、58、70、76、82、106 h 每時(shí)間點(diǎn)各取3孔終止培養(yǎng)，用三蒸水沖洗3次后每孔加入250 μL的乙醇溶液(960 mL/L)固定30 min;固定結(jié)束后棄原液，分別用1 g/L結(jié)晶紫染色(200 μL/孔)5 min;330 mL/L 冰醋酸洗去染液后，用酶標(biāo)儀分別測定各孔570 nm波長處的OD值，并以此繪制生長曲線［6］。

1.5 多細(xì)菌生物膜在根尖牙骨質(zhì)上形成的觀察

取因正畸減數(shù)拔除的人單根恒牙3個(gè)，用慢速切鋸切取長約3 mm的根尖，并沿長軸縱行劈開制成牙骨質(zhì)片;分別經(jīng)170 g/L EDTA浸泡10 min、52.5 g/L NaClO浸泡15 min、生理鹽水徹底沖洗后;放入每孔加有2 mL BHI的24孔板中。先分別在各孔中加入10 μL衣氏放線菌懸菌液，置37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h;然后再分別于每孔中加入血鏈球菌和糞腸球菌菌懸液各10 μL繼續(xù)培養(yǎng)。每天換1次BHI培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)至第5天時(shí)取出各牙骨質(zhì)片，用25 mL/L戊二醛溶液4℃固定過夜后，500、600、750、850、950、1 000 mL/L 乙腈梯度脫水;干燥、噴金，掃描電鏡觀察并拍照。

1.6 不同沖洗劑對多細(xì)菌生物膜作用的觀察

取8 mm×8 mm細(xì)胞爬片45片，三蒸水沖洗，120℃ 30 min高壓滅菌后，置于每孔加有2 mL BHI的24孔板中。先分別在各孔中加入10 μL衣氏放線菌菌懸液，并于37℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h;然后再分別于每孔中加入血鏈球菌和糞腸球菌菌懸液各10 μL繼續(xù)培養(yǎng)。每天換1次BHI培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)至第5天時(shí)取出所有細(xì)胞爬片，用三蒸水沖洗兩遍后按不同沖洗劑將其隨機(jī)分為5大組:生理鹽水沖洗組、SAEW 沖洗組以及 5、10、52.5 g/L NaClO沖洗組(生理鹽水為陰性對照，52.5 g/L NaClO為陽性對照);然后將每一大組按不同沖洗時(shí)間再各隨機(jī)分為3個(gè)亞組(15 s和1、5 min)。分別取上述各組爬片，并以相應(yīng)的沖洗劑(每片1 mL)距樣本1 cm進(jìn)行緩慢沖洗相應(yīng)的時(shí)間。沖洗結(jié)束后的各樣本分別用Live/dead熒光活死菌染色劑(激發(fā)波和吸收波分別為480/500 nm和490/635 nm)進(jìn)行染色后，激光共聚焦顯微鏡觀察，并用ImageJ軟件進(jìn)行分析［7］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 3種細(xì)菌相互作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3種細(xì)菌分別在BHI瓊脂平板以及營養(yǎng)缺乏的1/2 BHI瓊脂平板中共同厭氧培養(yǎng)12 h后，均可見形態(tài)完整的菌落，3種細(xì)菌間未出現(xiàn)明顯相互抑制(圖1)。

2.2 多細(xì)菌生物膜成膜情況的觀察

結(jié)晶紫染色觀察結(jié)果顯示，衣氏放線菌單菌種時(shí)，其細(xì)菌量(OD570 nm)在培養(yǎng)48 h內(nèi)始終維持在0.3左右;當(dāng)同時(shí)接種另外兩種細(xì)菌共同培養(yǎng)時(shí)，其OD值從24 h開始隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸升高，70 h后快速升高，82 h達(dá)到峰值，此后趨于穩(wěn)定(圖2)。

圖1 3種細(xì)菌在BHI和1/2 BHI培養(yǎng)基中的生長情況

圖2 多細(xì)菌生物膜生長曲線

2.3 多細(xì)菌生物膜在牙骨質(zhì)上形成的觀察

3種細(xì)菌接種于牙骨質(zhì)片上共同培養(yǎng)5 d后掃描電鏡觀察顯示:牙骨質(zhì)表面有大量表面光滑、形態(tài)完整的鏈狀、球狀和桿狀細(xì)菌(圖3 A～C);且各細(xì)菌相互聚集呈片狀或團(tuán)塊狀而形成的生物膜(圖3 a～c)。

2.4 不同沖洗劑對生物膜細(xì)菌的殺滅作用

激光共聚焦觀察顯示，各沖洗時(shí)間(15 s和1、5 min)組的生物膜中均以綠色熒光為主，僅有少量紅色熒光，且不隨時(shí)間的延長而有明顯改變(圖4)。與生理鹽水相比SAEW沖洗15 s組的綠色熒光明顯減少，隨著沖洗時(shí)間延長，紅色熒光逐漸增多，亮度也逐漸增強(qiáng)(圖 5);而各濃度(5、10、52.5 g/L)NaClO沖洗15 s組則以紅色熒光為主，且隨著沖洗時(shí)間延長而逐漸增多，但其亮度逐漸減弱(圖6)。

ImageJ軟件對各組的活菌比例進(jìn)行分析顯示:與生理鹽水組相比，SAEW 以及5、10、52.5 g/L Na-ClO沖洗15 s和1、5 min各組的活菌比例均顯著減少(P＜0.05)，其中SAEW 沖洗15 s組，5 g/L Na-ClO沖洗15 s和1、5 min組，10 g/L NaClO 沖洗15 s、1 min組的活菌比例均高于52.5 g/L NaClO相應(yīng)沖洗時(shí)間組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而SEAW沖洗1、5 min組，10 g/L NaClO沖洗5 min組的活菌比例分別與52.5 g/L NaClO相應(yīng)沖洗組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(圖7)。以上結(jié)果提示，SAEW以及不同濃度的NaClO沖洗劑均能有效殺死生物膜上的細(xì)菌，其中SAEW在沖洗15 s時(shí)的活菌比例雖明顯高于其他沖洗劑組，但延長沖洗時(shí)間至1 min即可達(dá)到與陽性對照組(52.5 g/L NaClO)相當(dāng)?shù)臍⒕Ч?/p>

圖3 多菌種生物膜在牙骨質(zhì)上形成的SEM觀察

圖4 生理鹽水沖洗不同時(shí)間后的多細(xì)菌生物膜CLSM圖像(600×)

圖5 強(qiáng)酸性電解質(zhì)水沖洗不同時(shí)間后的多細(xì)菌生物膜CLSM圖像(600×)

圖6 不同濃度次氯酸鈉沖洗不同時(shí)間后的多細(xì)菌生物膜CLSM圖像(600×)

圖7 各活菌比例比較

3 討論

在細(xì)菌感染造成的疾病中60%都與生物膜有關(guān)［8］。有研究證明，根尖外生物膜是引起尖周組織反復(fù)感染的主要原因;而細(xì)菌生物膜與浮游態(tài)細(xì)菌相比，具有更強(qiáng)的耐藥性和免疫抵抗性，僅靠機(jī)體自身免疫系統(tǒng)很難將其徹底清除［1］。

Leonardo等［9］通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)人的根尖外生物膜包繞于根尖及根尖牙骨質(zhì)表面，其中細(xì)菌主要由球狀菌、桿狀菌和絲狀菌組成。雖然有不少學(xué)者對根尖外生物膜的細(xì)菌組成進(jìn)行了相關(guān)研究，如Noguchi等［10］對根尖外細(xì)菌進(jìn)行 PCR－based 16srRNA測序，高陽［11］對根尖外的細(xì)菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)和鑒定，但均未得出完全一致的結(jié)果。有研究指出，放線菌常出現(xiàn)在持續(xù)性反復(fù)感染的根管內(nèi)，可能是造成根管外感染的原因之一，特別是與臨床相關(guān)的根尖放線菌病［12］。也有報(bào)道鏈球菌是根尖外生物膜中檢測出最多的細(xì)菌，其中以血鏈球菌為主;該菌是最早定居在牙面的細(xì)菌，可通過與唾液作用而粘附，并能與多種細(xì)菌發(fā)生聚集反應(yīng)［13］。另外，在根尖外感染中還發(fā)現(xiàn)有糞腸球菌，該菌能侵入牙本質(zhì)小管內(nèi)，并在營養(yǎng)缺乏的惡劣環(huán)境下生長，是難治性感染根管中最常檢出的細(xì)菌;且在根尖外細(xì)菌生物膜中也有發(fā)現(xiàn)［11］。根據(jù)以上研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選用根尖生物膜中常見的衣氏放線菌，糞腸球菌和血鏈球菌在根尖牙骨質(zhì)上共同培養(yǎng)，建立多細(xì)菌生物膜模型，并進(jìn)行相關(guān)研究。

結(jié)晶紫染色法是觀察生物膜上細(xì)菌生物量的手段之一，已有實(shí)驗(yàn)證明該方法所得結(jié)果與細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果密切相關(guān)［14］。本實(shí)驗(yàn)用結(jié)晶紫染色法檢測顯示，3種細(xì)菌所形成的生物膜隨著時(shí)間的延長其中的細(xì)菌量逐漸增加，72 h后達(dá)到峰值。表明3種細(xì)菌共同培養(yǎng)72 h后可以形成完整的多細(xì)菌生物膜。

目前臨床上去除根尖外生物膜的方法主要是進(jìn)行根尖外科手術(shù)，通過切除根尖3 mm有生物膜的組織，以消除細(xì)菌依附的環(huán)境;也有學(xué)者提出，可采用Er:YAG激光照射的方法去除根尖外生物膜，并進(jìn)行了體外研究［15］，但有關(guān)殺菌液沖洗去除根尖外生物膜的方法目前尚未有報(bào)道。對于根管內(nèi)生物膜，已有實(shí)驗(yàn)表明用SAEW對糞腸球菌生物膜進(jìn)行處理后，其作用與52.5 g/L NaClO結(jié)果相當(dāng)［16］。本結(jié)果顯示，與生理鹽水相比，SAEW以及不同濃度NaClO沖洗不同時(shí)間均能殺滅生物膜中的細(xì)菌。其中SAEW沖洗15 s時(shí)，生物膜中的活菌比例明顯高于其他組，但延長沖洗時(shí)間至1 min時(shí)即可達(dá)到與52.5 g/L NaClO相同的效果。有研究表明SAEW在環(huán)境中可自然降解成鹽水，與NaClO相比更安全并且無細(xì)胞毒性［17］。提示，SAEW在去除根尖外生物膜方面有著較好的應(yīng)用前景。

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