胡 超，李適廷，張 綱，譚穎徽

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院口腔科，重慶 400037)

DPSCs是Gronthos等(2000)從人第三磨牙牙髓中分離出的具有克隆源性的多潛能細(xì)胞［1］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DPSCs在體外能形成高密度散在的礦化結(jié)節(jié);植入免疫缺陷小鼠皮下能形成與天然牙齒結(jié)構(gòu)近似的牙髓 — 牙本質(zhì)復(fù)合體，從而證實(shí)DPSCs具有自我更新的能力［2］。另外，DPSCs還具有橫向分化的潛能，在不同的微環(huán)境作用下可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞。

Notch信號(hào)通路可通過細(xì)胞間相互作用的方式精確地調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，在生物體發(fā)育過程中決定著細(xì)胞的不同命運(yùn)［3］。目前已證實(shí)，Notch信號(hào)通路的激活是由兩個(gè)相鄰細(xì)胞的Notch受體與配體相互作用而實(shí)現(xiàn)的:位于相鄰細(xì)胞間的細(xì)胞膜上的Notch受體與配體結(jié)合后，可通過兩次酶切釋放出Notch1的胞內(nèi)段NICD，并進(jìn)而激活Notch信號(hào)通路［4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，采用慢病毒介導(dǎo)的RNAi抑制Notch配體Delata1的表達(dá)時(shí)，能夠抑制 DPSCs的增殖，促進(jìn)其分化［5］。然而，當(dāng)NICD過表達(dá)時(shí)對(duì)DPSCs有何生物學(xué)效應(yīng)目前尚缺乏研究。本實(shí)驗(yàn)在前期研究過表達(dá)NICD的基礎(chǔ)上，研究NICD在DPSCs上的表達(dá)及其對(duì)DPSCs的增殖和遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclon，美國(guó));胎牛血清(Gibco，美國(guó));CCK－8 試劑盒(DOJINDO，日本);Western blot相關(guān)試劑(武漢博士德);Notch1抗體(Cell Signaling，美國(guó));RNA提取試劑盒及實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)試劑盒(TAKARA，日本);Transwll小室(北京康寧);超凈工作臺(tái)(YG875型，蘇州);倒置顯微鏡(Olympus IMT－Z型，日本);凝膠成像系統(tǒng)(GelDco2000，美國(guó));所用引物由大連寶生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 人牙髓干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

選取16～25歲志愿者因正畸減數(shù)拔除的健康(無牙體牙周疾病)恒牙，無菌條件下取出牙髓組織，參照文獻(xiàn)［5］報(bào)道的方法，采用酶消化法分離、培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞(DPSCs);并分別經(jīng) vimentin、GFAP、nestin表達(dá)的檢測(cè)，以及成牙本質(zhì)誘導(dǎo)后標(biāo)志性蛋白DSPP表達(dá)的檢測(cè)和鈣化結(jié)節(jié)形成情況等鑒定后［5］，接種于100 mL的培養(yǎng)瓶;加入含100 mL/L胎牛血清(FBS)的 DMEM/F12于50 mL/L CO237℃ 條件下進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。取第2～3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定株的篩選

取生長(zhǎng)良好的第3代DPSCs，以每孔2×104的密度接種于24孔板，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，用本課題組前期構(gòu)建的NICD過表達(dá)的慢病毒按MOI值為50所對(duì)應(yīng)的病毒量轉(zhuǎn)染細(xì)胞;2 d后用含嘌呤霉素終濃度為0.8 μg/mL的培養(yǎng)基篩選，即可得到穩(wěn)定過表達(dá)NICD的細(xì)胞株。然后分別取經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)NICD的細(xì)胞株(DPSCs/NICD組)、經(jīng)空病毒感染的空載細(xì)胞株(DPSCs/vector組)以及正常細(xì)胞株(DPSCs/wt組)進(jìn)行以下檢測(cè)和觀察。

1.2.3 RT－PCR 檢測(cè) NICD 的 mRNA表達(dá)

分別取上述3組細(xì)胞株，用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后以cDNA為模板、GAPDH為內(nèi)參照，用以下引物(上游:5’－CGCGGATCCATGCACCTGGATGCCGCTGACCTG－3’;下游:5’－ACGTCTAGACTTGAAGGCCTCCGGAATGCG －3’)按 RT－PCR 試劑盒說明進(jìn)行特異性擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，隨后 94 ℃ 30 sec，60 ℃ 30 sec，72°C 30 sec，并進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后72℃ 5 min延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳(15 g/L瓊脂糖+6 μL EB制膠，電泳緩沖液為 TBE，每孔上樣約5 μL，電泳時(shí)間約40 min)后，用凝膠成像分析系統(tǒng)分析并拍照。

1.2.4 Western－blot檢測(cè) NICD 的蛋白水平表達(dá)

3組細(xì)胞用蛋白裂解液裂解細(xì)胞，待細(xì)胞充分裂解后收集裂解液，12 000 r/min離心10 min，取上清獲得總蛋白;并用BCA法測(cè)定蛋白濃度。然后取各組細(xì)胞總蛋白，以60 μg/孔上樣，用10%SDSPAGE膠進(jìn)行電泳。電泳后 PVDF轉(zhuǎn)膜，加入1∶1 000稀釋的一抗NICD 4℃孵育過夜;TBST洗膜，加入二抗37℃孵育1 h;DAB顯色、凝膠成像儀顯像后，以β－actin作為內(nèi)參照，用Quantity one軟件對(duì)蛋白質(zhì)印跡圖像進(jìn)行灰度分析，以NICD蛋白條帶與β－actin蛋白條帶的比值作為NICD表達(dá)的相對(duì)含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 CCK8法檢測(cè)3組細(xì)胞增殖的變化

分別取上述3組細(xì)胞以每孔5×103的密度接種于96孔板，37℃、50 mL/L CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5 d各時(shí)間點(diǎn)取各組細(xì)胞(每組5個(gè)復(fù)孔)，每孔加入10 μL CCK8繼續(xù)孵育4 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度值。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組細(xì)胞周期的變化

分別取上述3組細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌后加入至預(yù)冷的700 mL/L乙醇中4℃固定過夜;然后每組各取100 μL細(xì)胞懸液并分別加入碘化丙啶各5 μL，室溫靜置1 h后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞S期的比例。

1.2.7 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)NICD表達(dá)的位置

分別取上述3組細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，用40 g/L多聚甲醛固定10 min后PBS沖洗，50 g/L Triton穿孔15 min;PBS沖洗，50 g/L BSA封閉30 min;PBS沖洗，滴加1∶200稀釋的一抗NICD 4℃冰箱過夜，二抗37℃雜交2 min;DAPI避光染色5 min，抗猝滅封片劑封片，激光共聚焦下觀察并拍照。

1.2.8 Transwll檢測(cè)3組細(xì)胞的遷移能力

取康寧公司8 μm規(guī)格帶基質(zhì)膠的Transwell小室，鋪上無血清培養(yǎng)基與Matrigel膠8∶1稀釋的液體50 μL，12 h后吸出多余的液體備用。然后取上述3組細(xì)胞，分別用無血清的培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液后，各取100 μL(含3 000個(gè)細(xì)胞)接種于Transwell的上室;并在其下室加入 600 μL含100 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化劑，放入37℃、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后用棉簽刮除上室底部的基質(zhì)膠，PBS漂洗上表面3次后，用4℃預(yù)冷的40 g/L多聚甲醛固定細(xì)胞20 min;然后取出各小室，用PBS洗滌3次后風(fēng)干，用1 g/L的結(jié)晶紫染色30 min。染色后的各組小室分別用顯微鏡進(jìn)行觀察，并于高倍鏡下各隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算其細(xì)胞數(shù)，每組重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NICD mRNA在3組細(xì)胞中的表達(dá)

RT－PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，DPSCs/NICD組(實(shí)驗(yàn)組)的NICD mRNA表達(dá)較另外兩組明顯增強(qiáng)，而DPSCs/vector組(空載組)和DPSCs/wt組(正常對(duì)照組)的NICD mRNA表達(dá)均很弱，且兩組間無明顯差異(圖1)。進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄水平證明了DPSCs/NICD組NICD的mRNA表達(dá)水平增強(qiáng)。

2.2 NICD蛋白在3組細(xì)胞中的表達(dá)

Western－Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，DPSCs/NICD組的NICD蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.46±0.047，均明顯高于 DPSCs/vector組 0.233±0.022和 DPSCs/wt組0.218 ±0.023，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);而DPSCs/vector組與DPSCs/wt組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(圖2)。

圖1 RT－PCR檢測(cè)NICD mRNA在3組細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 western blot檢測(cè)NICD蛋白在3組細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 NICD過表達(dá)對(duì)DPSCs增殖的影響

2.3.1 CCK8 法檢測(cè)結(jié)果

培養(yǎng)1 d時(shí)，3組細(xì)胞的增殖速度均無明顯差異(P＞0.05);從第2天起到第5天各時(shí)間點(diǎn)，DPSCs/NICD組的細(xì)胞增殖速度均明顯高于另外兩組(P ＜0.05)，而 DPSCs/vector組與 DPSCs/wt組相比，各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖速度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(表 1)。

2.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞時(shí)項(xiàng)中S期的比列顯示:DPSCs/NICD組的S期比例最高，與另兩組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而DPSCs/vector組與DPSCs/wt組的S期比例相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(圖3、表2)。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染外源性NICD后的DPSCs處于增殖活躍狀態(tài)。

表1 各組細(xì)胞1～5 d內(nèi)的增殖情況比較()

表1 各組細(xì)胞1～5 d內(nèi)的增殖情況比較()

不同字母組間P＜0.05

吸光度值1 d 2 d 3 d 4 d 5 d DPSCs/NICD 0.6924 ±0.043a 1.0042 ±0.057a 1.3350 ±0.051a 1.7018 ±0.057a 1.8934 ±0.058組別a DPSCs/vector 0.7032 ±0.024a 0.8778 ±0.041b 1.1232 ±0.035 1.4590 ±0.039b 1.5996 ±0.067b DPSCs/wt 0.6994 ±0.031a 0.8993 ±0.030b 1.1136 ±0.062 1.4822 ±0.067b 1.5620 ±0.044b

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞周期的比例

表2 3組細(xì)胞S期百分率比較()

表2 3組細(xì)胞S期百分率比較()

不同字母組建P＜0.05

期百分率DPSCs/NICD 3 43.54 ±1.55組別 n S a DPSCs/vector 3 26.13 ±3.00b DPSCs/wt 3 24.91 ±1.50b

2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)NICD在3組細(xì)胞中的表達(dá)

熒光顯微鏡觀察顯示:單通道下3組細(xì)胞的DAPI染色均呈亮藍(lán)色，NICD染色在DPSCs/wt組和DPSCs/vector組中呈微弱綠色，但胞核中未見綠色表達(dá);而在DPSCs/NICD中亮度明顯增強(qiáng)，且在胞核中亦有綠色熒光表達(dá)，雙通道下胞核與胞質(zhì)完全對(duì)應(yīng)(圖4～6)。表明NICD在DPSCs/NICD組中的表達(dá)較另外兩組明顯增強(qiáng)，而且除胞膜和胞漿外，在細(xì)胞核中也有表達(dá)。

2.5 NICD過表達(dá)對(duì)DPSCs遷移能力的影響

Transwll檢測(cè)結(jié)果顯示:DPSCs/NICD組的遷移細(xì)胞數(shù)明顯高于DPSCs/wt組和DPSCs/vector組(P ＜0.05);而 DPSCs/vector組與 DPSCs/wt組遷移細(xì)胞數(shù)相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(圖7，表3)。表明轉(zhuǎn)染外源性NICD可增強(qiáng)DPSCs細(xì)胞的遷移能力。

圖4 DPSCs/wt DAPI和NICD熒光染料雙染(×800)

圖5 DPSCs/vector DAPI和NICD熒光染料雙染(×800)

圖6 DPSCs/NICD DAPI和NICD熒光染料雙染(×800)

圖7 3組細(xì)胞在高倍鏡下的細(xì)胞個(gè)數(shù)(×400)

表3 各組遷移的細(xì)胞數(shù)比較()

表3 各組遷移的細(xì)胞數(shù)比較()

不同字母組間P＜0.05

細(xì)胞個(gè)數(shù)DPSCs/NICD 5 32.40 ±4.669組別 n a DPSCs/vector 5 18.80 ±4.4944b DPSCs/wt 5 18.20 ±2.9496b

3 討論

DPSCs是位于牙髓組織中的一種成體干細(xì)胞，在正常情況下處于靜息狀態(tài)，并參與細(xì)胞的新舊更替，維持牙髓內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當(dāng)外界刺激導(dǎo)致牙本質(zhì)細(xì)胞受損時(shí)，DPSCs能夠分化成為成牙本質(zhì)細(xì)胞，并通過形成修復(fù)性牙本質(zhì)而參與組織的再生［6］。隨著人們對(duì)成牙機(jī)理的認(rèn)識(shí)和組織工程學(xué)的飛速發(fā)展，牙齒組織工程化已成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)，而DPSCs作為牙組織工程的種子細(xì)胞，已受到越來越多的關(guān)注。DPSCs與一些生物相容性材料植入裸鼠體內(nèi)能夠獲得牙髓－牙本質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)［7］，從而為牙體損傷修復(fù)開辟了一條新的路徑。

DPSCs在自身增殖及分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞的過程中，受到多種信號(hào)通路的調(diào)控，Notch信號(hào)通路就是其中非常重要的一種。本課題組前期分別通過慢病毒載體過表達(dá)Notch配體Delta1和RNAi抑制Notch配體Delta1，證明Notch信號(hào)通路能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的分化，維持細(xì)胞的原始梭形形態(tài)［5，8］。

Notch信號(hào)通路由兩個(gè)鄰近細(xì)胞的Notch受體與配體相互作用而激活。受體與配體結(jié)合后經(jīng)過α －轉(zhuǎn)化酶 (TNF－α converting enzyme，TACE)和 γ分泌酶的兩次酶切，釋放出Notch的胞內(nèi)段(Notch intracellular domain，NICD)，NICD轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)則可激活通路下游的基因。將外源性NICD編碼基因?qū)氚屑?xì)胞后，能夠活化Notch通路下游的基因，其對(duì)靶基因的調(diào)控與 Notch配體所誘導(dǎo)的Notch信號(hào)途徑的激活相一致［9－10］。因此，通過高表達(dá)NICD來模擬細(xì)胞內(nèi)Notch途徑上調(diào)的過程被廣泛應(yīng)用于Notch途徑的研究中［11］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染外源性NICD后的DPSCs增殖速度明顯加快，細(xì)胞周期中S期比例升高。細(xì)胞S期的比率能間接反映細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱，處于S期的細(xì)胞較其他期的細(xì)胞有更高的增殖能力［12］。Notch信號(hào)通路的受體Notch1主要分布在胞膜和胞漿上，而釋放的胞內(nèi)段NICD除了在胞膜和胞漿表達(dá)以外，在胞核也出現(xiàn)了表達(dá)，表明NICD在Notch信號(hào)通路中起到了一個(gè)信號(hào)傳遞的作用，并繼而在胞核內(nèi)激活下游基因的表達(dá)。Notch信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程關(guān)系密切，根據(jù)組織來源和細(xì)胞類型的不同，Notch的配體Notch1可以促進(jìn)或抑制細(xì)胞的遷移。有研究證實(shí)，在肺癌［13］、乳腺癌［14］中，Notch1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移;而在前列腺癌［15］中，轉(zhuǎn)染外源性Notch1能夠抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。然而，Notch1對(duì)DPSCs遷移的作用目前未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染外源性NICD后的DPSCs遷移能力明顯增強(qiáng)，表明當(dāng)牙髓損傷時(shí)，Notch信號(hào)通路被激活，從而促進(jìn)DPSCs能夠迅速遷移至牙髓損傷處，參與組織的修復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，當(dāng)牙髓損傷時(shí)可通過激活Notch信號(hào)通路而促進(jìn)DPSCs迅速增殖，并遷移至牙髓損傷處。然而Notch信號(hào)通路本身會(huì)抑制DPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，表明在內(nèi)環(huán)境調(diào)控修復(fù)性牙本質(zhì)生成的過程中，必然會(huì)有另外的調(diào)控機(jī)制與Notch產(chǎn)生協(xié)同和拮抗作用，因此還有待于進(jìn)一步研究。

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