王 英，謝 平，張 琳，劉興奎，喻 田

（1.青島市市立醫(yī)院麻醉科，山東青島 266011；2.貴州省麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室，貴州遵義 563003）

磷酯酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidy qinositol 3-kinase-protein kinase B，PI3K/Akt）途徑和細胞外調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）途徑共同組成了再灌注損傷挽救激酶（reperfusion injury salvage kinase，RISK）途徑，在心肌缺血/再灌注損傷中起重要的保護作用。目前，在離體動物的實驗中發(fā)現(xiàn)鉀通道開放劑（potassium channel openers，KCOs）的心肌保護作用是通過胞膜KATP通道（sarcolemmal ATP sensitive potassium channel，sarc-KATP）和線粒體 KATP通道（mitochondrial ATP sensitive potassium channel，mito-KATP）而實現(xiàn)的，并認為后者起主要作用。然而，在特異性mito-KATP開放劑二氮嗪（diazoxide，DZ）后處理減輕離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷中，是否通過RISK途徑而起到保護作用還鮮有報道。本研究擬采用Langendorff離體心臟灌注模型，應用DZ行藥物后處理，觀察其對缺血/再灌注心臟功能的影響，并探討DZ后處理是否通過激活RISK信號通路減輕離體大鼠缺血/再灌注損傷。

1 材料

1.1 實驗動物及分組 健康Sprague-Dawley成年大鼠32只（♀♂各半，由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，清潔級，證書號：SCXK（軍）2002008，隨機分為正常組（NOR）、對照組（CON）、二氮嗪后處理組（DZ）、LY拮抗二氮嗪組（DZ＋LY）。

1.2 主要試劑及儀器 Akt、Phospho-Akt、p70S6、Phospho-p70S6、eNOS、Phospho-eNOS、p44/42 MAP Kinase、Phospho-p44/42 MAP Kinase兔抗大鼠多克隆抗體（均為 CST公司產品），辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔 IgG（DakoCytomation公司），預染蛋白分子marker（Biolabs公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所），二氮嗪（diazoxide）、LY294002（LY）、二甲基亞砜（DMSO）、甲叉雙丙烯酰胺（bis-Acr）、三羥甲基氨基甲烷（hydroxymethyl aminomethane，Tris）、N-2-羥-酸 哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）均為 Sigma公司，其他生化試劑為國產分析純；Langendorff離體心臟灌注模型（西班牙，PanLab公司）、Powerlab/8SP實驗數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（澳大利亞，ADInstrument公司）、臺式高速冷凍離心機（Eppendorf，5804R型）、-80℃低溫冰箱（Forma，美國）、ELX-800酶標儀（BIO-TEC.INC，美國）、Mini Trans-Bloe電泳儀（BIO-RAD，美國）、全自動凝膠圖像分析儀（美國Syngene公司）。

1.3 主要液體配制 ①Kerbs-Henseleit緩沖液（成分單位：mmol· L-1，NaCl：118.00，KCl：4.75，CaCl2：2.50，NaHCO3：24.80，MgCl26H2O：1.19，KH2PO4：1.19，glucose：11.1）；ST.Thomas停跳液（成分單位：mmol·L-1，NaCl：110.00，KCl：16.00，CaCl2：1.20，MgCl2：16.00，NaHCO3：10.00 pH 7.8）；②8%SDS-PAGE分離膠30%丙烯酰胺、1.5 mol·L-1Tris緩沖液（pH 8.8）、10%APS、10%SDS、TEMED及5%SDS-PAGE積層膠；③ 電泳液（25 mmol·L-1Tris、250 mmol·L-1甘氨酸、0.1%SD）及電轉緩沖液（25 mmol·L-1Tris base、0.2 mol·L-1甘氨酸、20%甲醇）；④ PBS-T緩沖液 0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液加0.1%Tween-20。

2 方法

2.1 離體大鼠Langendroff全心缺血/再灌注模型的建立 大鼠ip給予戊巴比妥鈉40 mg·kg-1麻醉，肝素鈉500 U·kg-1抗凝，迅速開胸取心臟，立即放入預冷的K-H液（4℃），輕輕擠壓心臟洗凈殘留血液，液面下主動脈插管，固定置于Langendorff灌注管口。用37℃預先氧平衡的K-H液5.80kPa心臟逆行灌注，心臟跳動后于左心耳剪一小口，將帶有乳膠水囊的測壓管經二尖瓣插入左心室，連接Powerlab/8SP生物機能試驗壓力換能器系統(tǒng)，調節(jié)水囊使LVEDP為0.93kPa。

2.2 灌注方案 離體心臟37℃的K-H液平衡灌注20 min，平衡后監(jiān)測 HR＞200次/分、LVSP＞10kPa、室性早搏＜2個/分，未達條件者舍棄。NOR組平衡后無處理續(xù)灌70 min；CON組平衡后，缺血40 min，再續(xù)灌30 min；DZ組于再灌注開始即刻，主動脈逆灌50μmol·L-1二氮嗪5min；DZ＋LY組于再灌注開始即刻主動脈灌注LY 15μmol·L-1持續(xù)5 min后，二氮嗪后處理5 min；除去NOR組均給予灌注4℃ST.Thomas停跳液10 ml·kg-1，繼之停止灌注泵造成全心缺血，所有心臟在常溫下缺血40 min后，再次灌注37℃含氧灌注液30 min后，取左室組織迅速置于液氮中保存，分別于平衡20 min末和再灌注30 min末時采集心臟功能各項參數(shù)。

2.3 心臟功能測定 各組分別于平衡末和再灌注30 min末測定下列心臟血液動力學參數(shù)：心率（heart rate，HR）、冠脈流量（coronary flow，CF）、左心室發(fā)展壓（left ventricular developed pressure，LVDP）、左心室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左心室內壓上升最大速率（themaximum rate of increase of left ventricular pressure，＋d p/d tmax）和左心室內壓下降最大速率（the maximum rate of decrease of left ventricular pressure，-d p/d tmax）。

2.4 蛋白質的提取及W estern blot檢測心肌Akt、P70S6K、eNOS、ERK磷酸化水平 從液氮中取出心肌組織稱量，按3 ml·g-1比例加入4℃組織裂解液（50mmol·L-1Tris.HCl、pH 7.4、1 mmol·L-1PMSF、50 mmol·L-1NaF、150 mmol·L-1NaCl、5 mmol·L-1EDTA、0.45mmol·L-1EGTA、1%Triton X-100、2 m l·g-1aprotinin、2 m l·g-1leupeptin、5 mg·L-1pepstatin、1%Tween-20），冰浴中剪碎組織，超聲勻漿至組織成糜狀，靜置1 h，14 000×g離心1 h，取上清，14 000×g再離心30 min，取出上清液，用BCA法測定待測樣品的蛋白濃度（按BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書操作），最后取上清蛋白分裝。分別根據(jù)目的蛋白分子量配制8%SDS-PAGE分離膠，上樣量為20μg/20μl，按標本與上樣緩沖液體積4∶1加入5X上樣緩沖液，總體積25μl?；靹蚝笾蠓? min，上樣電泳、轉膜，一抗孵育過夜，二抗標記孵育1 h，熒光顯色劑染膜，X線片曝光，顯影、定影。采用Image-ProPlus圖像分析軟件（Version4.1，Media Cybernetics，LP，USA）對蛋白條帶進行半定量分析。

2.5 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)按完全隨機對照設計的要求收集整理，所有數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，各組間數(shù)據(jù)計量資料用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差（ANOVA）分析，處理前后數(shù)據(jù)用配伍t檢驗。

3 結果

3.1 離體大鼠心臟心功能 4組離體鼠心平衡末、再灌注末30min時心率（HR）、冠脈流量（CF）、左心室發(fā)展壓（LVDP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、壓力瞬時最大變化率（±d p/d tmax）結果如下（Tab 1～3）。各組間平衡末比較差異無顯著性（P＞0.05）；NOR組組內再灌注30 min與平衡末比CF差異無顯著性，余各組組內再灌注30 min與平衡末比 HR、LVDP、±d p/d tmax明顯降低（P＜0.01），LVEDP明顯增加（P＜0.01）；DZ組再灌注末 HR、CF、LVDP、±d p/d tmax與CON組、DZ＋LY組比明顯增加（P＜0.01），LVEDP明顯降低（P＜0.01）。

Tab 1 Change of isolated heart HR and CF in four groups（±s，n＝8）

Tab 1 Change of isolated heart HR and CF in four groups（±s，n＝8）

＃＃P＜0.01 vs NOR；△△P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs DZ；☆P＜0.05，☆☆P＜0.01 30min-reperfusion vs20min-equilibration.

Group At theend ofequilibration HR/beats·min-1 CF/ml·min-1 At theend of reperfusion HR/beats·min-1 CF/ml·min-1 NOR 329±11 12.93±0.81 311±9☆12.34±0.57 CON 325±7 12.36±1.02 213±17☆☆ 4.16±0.52☆☆DZ 331±12 13.33±0.75 256±11＃＃△△☆☆ 10.03±0.58＃?！鳌鳌睢頓Z＋LY 324±7 12.16±0.67 202±14**☆☆ 3.65±0.52**☆☆

Tab 2 Change of isolate hearts LVDP and LVEDP in four groups（xˉ±s，n＝8）

Tab 2 Change of isolate hearts LVDP and LVEDP in four groups（xˉ±s，n＝8）

＃＃P＜0.01 vs NOR；△△P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs DZ；☆P＜0.05，☆☆P＜0.01 30min-reperfusion vs20min-equilibration.

Group At the end ofequilibrantion At the end of reperfusion LVDP/kPa LVEDP/kPa NOR 10.85±0.65 1.01±0.03 9.14±0.66☆ 1.27±0.09 LVDP/kPa LVEDP/kPa☆☆CON 10.99±0.43 1.01±0.04 3.76±0.45☆☆ 4.39±0.43☆☆DZ 11.39±0.47 0.98±0.02 7.27±0.85＃?！鳌鳌睢?.58±0.22＃＃△△☆☆DZ＋LY 11.10±0.54 0.99±0.03 2.98±0.54**☆☆ 4.62±0.53**☆☆

Tab 3 Change of isolate hearts＋d p/d t m ax and－d p/d t m ax in four groupsˉx±s，n＝8）

Tab 3 Change of isolate hearts＋d p/d t m ax and－d p/d t m ax in four groupsˉx±s，n＝8）

＃＃P＜0.01 vs NOR；△△P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs DZ；☆☆P＜0.01 30min-reperfusion vs 20min-equilibration

Group-1 NOR 255±18 212±16 225±13☆☆ 172±12 At theend ofequilibrantion＋d p/d t max/kPa·s-1-d p/d t max/kPa·s-1 At theendof reperfusion＋d p/d t max/kPa·s-1-d p/d t max/kPa·s☆☆CON 263±16 205±22 115±21☆☆ 47±8☆☆DZ 273±18 235±17 165±12＃?！鳌鳌睢?113±11＃＃△△☆☆DZ＋LY 257±18 209±13 91±21**☆☆ 46±12**☆☆

3.2 W estern blot檢測心肌 Akt、P70S6K、eNOS、ERK磷酸化水平 再灌注末DZ組Akt、P70S6K、eNOS磷酸化水平明顯高于NOR組、CON組、DZ＋LY組（P＜0.01），但各組ERK的磷酸化水平沒有明顯區(qū)別，p-Akt/t-Akt、p-P70S6/t-P70S6、p-eNOS/t-NOS、p-ERK/t-ERK為蛋白條帶灰度值的比值，見Fig 1～8。

3.2.1 Akt磷酸化表達情況 見Fig 1、2。

Fig 1 Four groupsof total Akt and phosphorylated Akt electrophoresis images

3.2.2 P70S6磷酸化表達情況 見Fig 3、4。

3.2.3 eNOS磷酸化表達情況 見Fig 5、6。

3.2.4 ERK磷酸化表達情況 見Fig 7、8。

Fig 2 Level of phosphoric acid expressions of Akt in LV of rats from four groups（ˉx±s，n＝3）＃＃P＜0.01 vs NOR；△△P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs DZ

Fig 3 Four groups of total P70S6 and phosphorylated P70S6 electrophoresis images

Fig 4 Level of phosphoric acid expressions ofP70S6 in LV of rats from four groups（±s，n＝3）＃＃P＜0.01 vs NOR；△△P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs DZ

4 討論

心肌缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是臨床上常見的病理生理過程，人們對IRI的機制和抗損傷的措施進行了大量研究，其中2003年Zhao等［1］提出了缺血后處理（ischemicpostconditioning，IPTC），并在動物模型上證實了后處理的保護效果，IPTC能夠有效地減輕再灌注損傷，而藥物后處理是在缺血后再灌注之前給予某種藥物使之產生與IPTC相似的保護效果。目前研究表明，二氮嗪、揮發(fā)性麻醉藥、胰島素、緩激肽等藥物都具有后處理的保護作用［2-4］。二氮嗪［5］、七氟醚［6］及多種細胞因子均可通過激活PI3K-Akt信號轉導系統(tǒng)，抑制心肌細胞凋亡，促進心肌細胞存活，其中Akt活化是這些信號轉導通路發(fā)揮心臟保護作用的關鍵。目前PI3K/Akt和ERK1/2作為治療新靶點日益受到關注。具體的說，IPTC激活RISK途徑，其上游可能是激活了G蛋白偶聯(lián)受體如腺苷受體，尤其是A2和A3受體，其下游可能激活了GSK3β、eNOS、蛋白激酶Cε（PKCε），最終作用于線粒體和鉀離子通道，減少mPTP開放和增加鉀離子通道開放［7-9］，從而保護心肌細胞抵抗細胞內和線粒體內鈣超載、氧化應激反應和ATP耗竭。

本研究結果表明，與CON組和DZ＋LY組比，DZ后處理組，其 LVDP、HR、CF、＋d p/d tmax、-d p/d tmax明顯增加（P＜0.01），LVEDP明顯降低（P＜0.01），能明顯改善離體缺血/再灌注大鼠心臟的功能，提示DZ后處理能有效減輕IRI，具有心肌保護作用，表明mito-KATP敏感性鉀通道在后處理中起到關鍵作用。本實驗中，再灌注末DZ組 PKB/Akt、eNOS、P70S6K磷酸化水平的表達明顯高于 NOR組、CON組，而PI3K抑制劑LY294002可取消這種作用，并取消DZ改善心功能的效應。各組ERK1/2磷酸化水平的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明二氮嗪后處理可能激活了PI3K-Akt信號途徑，并且也激活其下游靶點eNOS、P70S6K，使它們磷酸化水平增強，從而抑制心肌細胞的凋亡，產生心肌保護效應。但各組ERK的磷酸化水平沒有明顯區(qū)別，提示DZ后處理并沒有影響ERK1/2磷酸化的表達。

Fig 5 Four groups of total eNOS and phosphorylated eNOS electrophoresis images

Fig 6 Level of phosphoric acid expressions of eNOS in LV of rats from four groups（±s，n＝3）＃＃P＜0.01 vs NOR；△△P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs DZ

Fig 7 Four groups of total ERK and phosphorylated ERK electrophoresis images

Fig 8 Level of phosphoric acid expressions of ERK in LV of rats from four groups（±s，n＝3）

目前對于PI3K/Akt和ERK1/2在后處理中的相對重要性仍存有爭議。Darling等［10］在兔離體心臟缺血后處理模型的研究中發(fā)現(xiàn)后處理激活的是ERK1/2，而非PI3K/Akt。而另一項關于緩激肽藥理后處理的研究則表明ERK1/2就是PI3K/Akt的一個下游底物［11］。這些觀點的分歧可能與實驗動物、后處理的方式以及所取標本的部位不同有關。在以往的研究中［12］也顯示，PI3K/Akt和 ERK1/2的活化無論是在心肌肥厚還是在缺血或衰竭的心臟中，都是一個復雜的多相的時間點過程。雖然本實驗表明ERK1/2沒有被DZ后處理所激活，但是不能排除ERK1/2在后處理中的心肌保護作用，因為我們不能排除可能積累的磷酸化在特定的亞細胞上起作用，而且蛋白質磷酸化與非磷酸化的過程本身就是個可逆的過程，在實驗中也不能確定磷酸化只在單一的時間點內發(fā)生，所以對于DZ后處理是否激活ERK1/2途徑，其機制如何還有待進一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，各組 PKB/Akt、P70S6K、eNOS磷酸化表達的變化與其對應的離體鼠心心臟功能的改變，具有一定的聯(lián)系，推測DZ后處理可能是通過開放 mito-KATP通道，啟動某種內源性機制激活PI3K-Akt信號途徑，抑制心肌細胞的凋亡而保護心肌。因此，可以認為DZ后處理可激活PI3K-Akt信號途徑，而激活的PI3K-Akt信號途徑又能促使mito-KATP通道的開放，二者都能抑制心肌細胞的凋亡，協(xié)同發(fā)揮作用，最終產生心肌保護效應。

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