孫協(xié)軍，李秀霞，劉雪飛，勵建榮，呂艷芳，李 嬌，王 珍，田 鑫

(渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”，遼寧錦州121013)

山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)通常是指薔薇科(Rosaceace)山楂屬(Crataegus L.)植物的干燥果實，分為山里紅(Crataegus pinnatifida Bge var.Major N.E.Br.)和 野 山 楂 (Crataeguscuneata Sieb.＆Zucc.)［1］，其中，山里紅也叫北山楂，在我國北方地區(qū)廣泛栽培，是重要的藥食同源植物。黃酮類化合物、原花青素、三帖酸等是山楂中主要的生物活性成分，目前，從山楂中分離得到60余種黃酮類化合物，主要包括以芹菜素和木犀草素為苷元的苷類以及以蘆丁、金絲桃苷和槲皮素為主的黃酮醇及氧苷類物質(zhì)［2－4］。黃酮類化合物具有降血脂［5］、降血糖［6－7］、預(yù)防肝損傷［8－9］、抗氧化［10］及提高機體免疫力［11］等生理活性，是山楂果實及葉片中主要的生物活性成分。目前提取黃酮的方法主要有浸提［12－13］、超聲波輔助提?。?4］、微波提取法［15］和酶法［16］等，超聲波輔助提取法是一種從植物中提取有效部分的重要方法，超聲空化作用能使細(xì)胞壁破裂從而有助于內(nèi)容物的浸出，增加了溶劑向細(xì)胞內(nèi)的擴散和有效成分的溶出，超聲還有助于黃酮類物質(zhì)的凝聚［17］，從而大大縮短了提取時間，提高提取效率，且對被提取物質(zhì)不產(chǎn)生破壞作用，因而近年來被廣泛用于植物有效成分的提取研究［18］，據(jù)報道，超聲波輔助提取可以提高山楂葉及果實中黃酮的提取效率［14－19］。蘆丁、槲皮素和金絲桃苷為北山楂果實中主要含有的黃酮類化合物［20－21］，本文以北山楂果實為實驗原料，以3種黃酮總得率為衡量指標(biāo)，對山楂黃酮超聲波輔助提取工藝進行優(yōu)化，通過本實驗的研究，為北山楂果實中黃酮類化合物的有效開發(fā)和利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山楂 市售，產(chǎn)地遼西地區(qū);蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞97%)購于中國藥品生物制品檢定所;金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98.5%)購于寶雞市辰光生物科技有限公司;高效液相色譜檢測所用試劑均為色譜純，水為超純水，其它試劑為分析純。

P680型高效液相色譜儀 美國戴安公司;FA2004型電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;RE－2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ－D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵 上海申光儀器有限公司;SCIENTZ－ⅡD型超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝超聲設(shè)備有限公司;PS02－AD－DI超純水機 上海訊輝環(huán)?？萍加邢薰尽?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 山楂樣品預(yù)處理方法 選擇整齊度良好的新鮮山楂自來水清洗后去除果核，帶皮果肉部分在50℃熱風(fēng)烘干后粉碎成細(xì)果粉，全部過40目分樣篩后真空封裝，冷藏備用。

1.2.2 超聲波輔助提取方法 準(zhǔn)確稱取5g山楂果粉樣品于100mL小燒杯中，按照實驗設(shè)計分別加入適量的乙醇溶液，在相應(yīng)的超聲波功率下提取一段時間后減壓抽濾，收集濾液于60℃減壓濃縮至膏狀后，甲醇溶解并定容至50mL。

1.2.3 液相色譜檢測條件 Develosil C30(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱;流動相:A相為乙腈，B相為0.4%磷酸水溶液，梯度洗脫，80% B～60.5%B(0～26min)，80%B平衡4min后進下一個樣品;流速1mL/min;柱溫40℃;進樣20μL;檢測波長:360nm。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 各取蘆丁、金絲桃苷和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品48、15和4.5mg，甲醇溶解并分別定容至10mL，得到濃度分別為4.8(蘆丁)、1.5(金絲桃苷)和0.45mg/mL(槲皮素)的3種標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，分別吸取同體積各標(biāo)準(zhǔn)貯備液，稀釋為6個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，濃度分別為:蘆丁，0.005、0.01、0.02、0.04、0.08 和 0.16mg/mL;金絲桃苷，0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.001563mg/mL;槲皮素，0.015、0.0075、0.00375、0.001875、0.000938、0.000469mg/mL。

1.2.5 山楂黃酮得率的計算方法 山楂黃酮得率(%)=(提取液中3種黃酮濃度總和×定容體積)/(稱樣質(zhì)量×100)

1.2.6 提取單因素實驗設(shè)計

1.2.6.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響 在超聲波功率為600W條件下，選取液固比為20mL/g和體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液作為提取劑超聲波輔助提取10min，比較山楂黃酮得率。

1.2.6.2 液固比的影響 在超聲波功率為600W條件下，選取體積分?jǐn)?shù)為80%和液固比分別為10、15、20、25、30mL/g的乙醇溶液超聲波輔助提取10min，比較山楂黃酮得率。

1.2.6.3 超聲波功率的影響 在超聲波功率分別為450、550、650、750、850W 條件下，選取體積分?jǐn)?shù)為80%和液固比為20mL/g的乙醇溶液為提取劑超聲波輔助提取10min，比較山楂黃酮得率。

1.2.6.4 提取時間的影響 在超聲波功率為600W條件下，選取體積分?jǐn)?shù)為80%和液固比為20mL/g的乙醇溶液為提取劑分別超聲波輔助提取10、20、30、40、50min，比較山楂黃酮得率。

1.2.7 提取響應(yīng)面分析實驗設(shè)計 為進一步確定最佳超聲波輔助提取條件和各因素的影響順序，依據(jù)design－expert 7.0進行響應(yīng)面實驗設(shè)計，以3種黃酮總得率為考察指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、液固比(X2)、超聲波功率(X3)和提取時間(X4)為自變量，共設(shè)立30個處理組，具體實驗設(shè)計見表1。

表1 山楂黃酮超聲波輔助提取響應(yīng)面實驗設(shè)計Table 1 Response surface experiment design of ultrasound assisted extraction of hawthorn flavonoid

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分離結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

所配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.45μm膜過濾后分別進樣，每個濃度進樣3次，黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及山楂提取液的液相色譜圖見圖1－A和圖1－B所示，圖2提取液中3種黃酮分別采用保留時間和DAD光譜掃描圖(圖形略)結(jié)合定性。從圖1－B可以看出，山楂提取液中的槲皮素色譜峰與其它色譜峰效果較好，而蘆丁和金絲桃苷沒有達(dá)到基線分離，但分離度也達(dá)到了1.0以上，可用于這2種黃酮定量分析使用。以峰面積為橫坐標(biāo)，3種黃酮濃度平均值(mg/mL)為縱坐標(biāo)，得到3條標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:蘆丁，Y=538.31X－0.3226(R2=0.9999;線性范圍為0.0005－0.16 mg/mL)，金絲桃苷，Y=828.86X(R2=0.9996;線性范圍為0.0016～0.05 mg/mL)，槲皮素，Y=550.85X+0.044(R2=0.9997;線性范圍為0.0005～0.015 mg/mL)。

2.2 山楂黃酮超聲波輔助提取的單因素實驗結(jié)果

圖1 黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和山楂黃酮提取液(B)色譜圖Fig.1 Chromatogram of flavonoid mixture standard(A)and hawthorn flavonoid extract(B)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對山楂黃酮超聲波提取得率的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對山楂黃酮得率的影響如圖2所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)對山楂黃酮提取效率的影響較大，體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇黃酮得率最高，這與李寧豫等實驗結(jié)果［14］一致，此時，山楂黃酮類化合物的溶解性最好，其次是90%乙醇，無水乙醇和體積分?jǐn)?shù)較低的乙醇提取效果較差，分析其原因，可能是因為本實驗中山楂黃酮提取物主要以蘆丁和金絲桃苷兩種黃酮苷為主，提取液中槲皮素含量相對較低，在80%～90%乙醇溶液中溶解性高于無水乙醇和體積分?jǐn)?shù)較低的乙醇，提取效果較好，因此選擇體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇進行實驗。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on flavonoid yield

2.2.2 液固比對山楂黃酮超聲波提取得率的影響液固比對山楂黃酮得率的影響見圖3所示，隨著液固比的增大，黃酮得率也隨之增大。這主要是因為隨著液固比的增大，山楂粉末與提取液黃酮的濃度差增大，黃酮類化合物就越容易滲透出來;當(dāng)液固比增大到一定值后，由于山楂中黃酮類化合物的含量有限，黃酮得率的增加趨于平緩。而且，液固比越大，溶劑的用量增加，后繼處理步驟耗能增加，導(dǎo)致提取成本增高，因此，確定液固比25mL/g為最佳。

圖3 液固比對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of liquid to solid ratio on flavonoid yield

2.2.3 超聲波功率對山楂黃酮超聲波提取得率的影響 超聲波功率對山楂黃酮得率的影響如圖4所示，功率增大到550W時，黃酮得率已經(jīng)達(dá)到頂峰，以后隨超聲波功率的增加黃酮得率逐漸降低，這主要是由于高功率的超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)較強，而高溫對黃酮類化合物有一定的破壞作用，又考慮到功率越高，生產(chǎn)成本越高，選擇超聲波功率550W為最佳。

圖4 超聲波功率對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on flavonoid yield

2.2.4 提取時間對山楂黃酮超聲波提取得率的影響 提取時間對山楂黃酮提取得率的影響如圖5所示，從圖5看出，超聲波在較短的時間內(nèi)就可以達(dá)到較高的提取效率，在20min時，黃酮得率最高，之后隨著時間繼續(xù)增加，得率有下降的趨勢，這可能是由于提取時間過長，導(dǎo)致的熱效應(yīng)使得一些黃酮類化合物損失，選擇20min進行以下實驗。

圖5 提取時間對黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extracting time on flavonoid yield

2.3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果分析

通過單因素實驗，選取乙醇濃度(X1)、料液比(X2)、提取功率(X3)和提取時間(X4)進行四因素三水平的響應(yīng)面實驗，實驗設(shè)計的因素、水平和實驗結(jié)果見表2。用Design－expert 7.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到山楂中黃酮類化合物得率的回歸方程如下:

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results

表2 響應(yīng)面實驗結(jié)果及分析Table 2 Experimental results and analysis of the response surface

續(xù)表

方差分析結(jié)果見表3，由表3可以看出，模型的F值極顯著(p＜0.01)，而失擬的F值不顯著(p＞0.05)，模型的相關(guān)系數(shù)R2為82%，說明模型擬合程度較好，實驗誤差較小，該模型是合適的，因此可以用該模型方程來分析和預(yù)測不同超聲波輔助提取條件下山楂中黃酮類化合物的得率變化。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，四個考查因素對山楂中黃酮類化合物得率影響的順序為:液固比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時間＞超聲波功率，在所選擇的超聲波功率范圍內(nèi)，超聲功率對山楂黃酮得率沒有顯著影響(p＞0.05)。

從表3可以看出，液固比和提取時間、超聲波功率和提取時間之間存在交互作用，其響應(yīng)面圖和等高線圖分別見圖6和圖7所示。從圖6的響應(yīng)面圖可以看出，液固比和提取時間對山楂中黃酮類化合物得率均有較大影響，且隨著液固比和提取時間的增加，黃酮得率均呈先增加后變緩的趨勢，其中液固比的影響稍大于提取時間，而超聲波功率對山楂中黃酮類化合物提取得率影響較小(見圖7)。

圖6 液固比和提取時間的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graph of L/S ratio and extracting time

圖7 超聲波功率和提取時間的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface graph of ultrasonic power and extracting time

通過design expert7.0軟件擬合，得出最佳超聲波輔助提取山楂黃酮的工藝參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液固比25.5mL/g，超聲波功率600W，提取時間為24.9min，在此優(yōu)化條件下山楂黃酮得率預(yù)測值為0.0352%，實測值為0.0363%，與預(yù)測值的相對誤差為3.125%，與預(yù)測結(jié)果相符。

3 結(jié)論

建立了以乙腈和0.4%磷酸水溶液為流動相的山楂蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的分離和定量方法，以3種黃酮得率為響應(yīng)值，建立了超聲波輔助提取山楂黃酮的數(shù)學(xué)模型，各因素影響的主次順序為:液固比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時間＞超聲波功率。通過對提取過程工藝的研究，確定了超聲波提取山楂黃酮的最佳工藝參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液固比25.5mL/g，超聲波功率600W，提取時間為24.9min，該工藝條件下的山楂黃酮得率為0.0363%，與預(yù)測結(jié)果相符。

［1］馮鳳蓮，張卉朱.山楂的研究進展［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1997，18(6):383－385.

［2］Melikoglu G，Mericli F，Mericli A H.Flavonoids of Crataegus orientalis［J］.Bollettino Chinico Farmaceutico，1999，138(7):209－239.

［3］劉榮華，余伯陽.山里紅葉化學(xué)成分研究［J］.中藥材，2006，29(11):1169－1173.

［4］孫敬勇，楊書斌，謝鴻霞，等 .山楂化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2002，33(6):483－486.

［5］蘇曼曼，于曉風(fēng)，曲紹春，等.分蘗蔥頭總黃酮對實驗性高脂血癥大鼠血脂代謝的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2007，23(12):1594－1597.

［6］葉希韻，張隆，沈菊，等.山楂葉總黃酮對糖尿病小鼠糖脂代謝的影響［J］.中草藥，2005，36(11):1683－1687.

［7］王勇，趙海燕.植物黃酮類治療糖尿病藥理機制的研究進展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2010，16(4):612－615.

［8］郭菁菁，楊秀芬.黃酮類化合物對動物實驗性肝損傷保護作用的研究進展［J］.中國藥理學(xué)通報，2008，24(1):5－10.

［9］李滿妹，江 濤，黃杰昌，等.知母總黃酮對溴酸鉀誘發(fā)小鼠肝損傷的保護作用［J］.中草藥，2008，39(2):252－255.

［10］唐瑛，羅祖友，嚴(yán)奉偉，等.藤茶總黃酮對小鼠的體內(nèi)外抗氧化作用研究［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006，26(12):1449－1452.

［11］閻莉，鄭作文，衛(wèi)智權(quán).廣西藤茶總黃酮對正常小鼠免疫功能的影響［J］.中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2008，5(4):5－7.

［12］韓秋菊.山楂中黃酮類化合物提取工藝條件優(yōu)化［J］.化學(xué)與生物工程，2012，29(6):85－87.

［13］霍丹群，張文，李奇琳，等.超聲波法與熱提取法提取山楂總黃酮的比較研究［J］.中成藥，2004，26(12):1063－1065.

［14］李寧豫，韓秋菊，曹月坤.超聲輔助提取山楂黃酮的研究［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，3:91－93.

［15］韓秋菊.微波輔助法提取山楂黃酮類化合物的工藝條件研究［J］.藥物分析雜志，2011，39(14):8612－8614.

［16］王曉，李林波，馬小來，等.酶法提取山楂葉中總黃酮的研究［J］.食品工業(yè)科技，2002，23(3):37－39.

［17］薩燕平，彭永芳.超聲輻射提取槐花米中的蘆?。跩］.云南化工，1996，4:25－26.

［18］郭輝，羅宇倩，章華偉，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取荷葉黃酮工藝研究［J］.中國食品學(xué)報，2011，11(1):119－125.

［19］趙永福.超聲波輔助提取山楂葉總黃酮的工藝研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(19):10076－10077，10111.

［20］王珍，李秀霞，李嬌，等.高效液相色譜法測定山楂中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量［J］.食品工業(yè)科技，2013，34(9):302－305.

［21］暴鳳偉，劉玉強，張振秋，等.HPLC法測定山楂提取物中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的含量［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31(2):24－26.