丁 爽 賈文霄 許永華 楊利霞 黃自麗 潘曉東

抗血管生成藥物是目前腫瘤藥物治療的重要策略。該藥物的研發(fā)迫切需要建立有效、便捷的生物標(biāo)志物早期監(jiān)測腫瘤的血流動力學(xué)變化、細(xì)胞代謝等，以評價(jià)藥物的早期療效，指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥[1]。常規(guī)影像學(xué)檢查方法仍是目前臨床最常用的腫瘤分期及療效評價(jià)的主要手段[2]。但這種臨床療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對于抗腫瘤血管藥物療效的評價(jià)存在明顯不足。隨著現(xiàn)代影像技術(shù)的發(fā)展，多參數(shù)影像學(xué)生物標(biāo)志物已成為潛在的“替代終點(diǎn)” 來替代常規(guī)的臨床觀察終點(diǎn)[3]。其中磁共振彌散加權(quán)成像（diffusion weighted imaging，DWI）是目前唯一無創(chuàng)測定體內(nèi)水分子擴(kuò)散運(yùn)動的方法，在腫瘤分級及各種治療手段（如放療、化療）的療效評估都具有較重要的作用[4-5]。目前，DWI技術(shù)及后處理軟件的日趨完善，多b值DWI技術(shù)正在成為學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。該技術(shù)有望除能夠反映細(xì)胞代謝外，還能反映抗腫瘤血管藥物治療后血管關(guān)閉情況[1,6]。本研究以結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型為研究對象，動態(tài)觀察抗癌藥物治療前后DWI各參數(shù)的早期變化，并與免疫組化行相關(guān)性分析，以明確多b值DWI各定量參數(shù)在評價(jià)抗血管生成藥物早期反應(yīng)方面的應(yīng)用價(jià)值。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)對象及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

BALB/c-nu雌性裸鼠，鼠齡4～6周，體重14～18g，人型結(jié)腸癌Ht-29細(xì)胞株，由中科院上海生命科學(xué)研究院提供。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審核通過。參考文獻(xiàn)[7]建立結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型。成瘤后由同一測量者用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最大直徑（a）和最小直徑（b），按公式V= ab2π/6計(jì)算腫瘤體積，建模成功的標(biāo)準(zhǔn)為移植瘤體積達(dá)200 mm3。

建模成功的30只結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型隨機(jī)分為三組：抗腫瘤血管藥物治療組（n=10）：腹腔注射貝伐珠單抗注射液（商品名安維汀注射液），注射劑量10mg/kg（每只載瘤裸鼠注射約200 μg）；細(xì)胞毒性藥物治療組（n=10）：腹腔注射5-氟尿嘧啶注射液，注射劑量150mg/kg；對照組（n=10）：按20mg/kg腹腔注射9%生理鹽水。所有載瘤裸鼠均在治療前行基礎(chǔ)MRI檢查，隨后每組于基礎(chǔ)檢查后的第二天分別在相應(yīng)藥物治療后1h、24h、48h行MRI，48hMRI檢查結(jié)束后處死載瘤裸鼠行病理免疫組化染色。

2. MRI檢查方法及圖像分析

采用西門子1.5T Tim Avanto磁共振掃描儀，25mm實(shí)驗(yàn)動物專用4通道顯微線圈。軸位掃描，T1WI序列：TR/TE=280 ms/18 ms；T2WI序列：TR/TE=3000 ms/82 ms；層厚2.0 mm，層間距0.0 mm，F(xiàn)OV 60～70 mm。多b值DWI掃描：采用10個(gè)擴(kuò)散敏感梯度因子b值，分別為0 s/mm2、50 s/mm2、100 s/mm2、150 s/mm2、200 s/mm2、250 s/mm2、300 s/mm2、500 s/mm2、750s/mm2、1000 s/mm2。

將T2WI輸入Biomap軟件，人工劃取每個(gè)掃描層面包含全部腫瘤組織的感興趣（ROI），根據(jù)腫瘤體積=每層腫瘤面積之和×（層厚+層間距）計(jì)算獲得腫瘤體積[3]。

將10個(gè)b值的DWI圖像輸入biomap軟件內(nèi)，計(jì)算獲得不同b值的表觀擴(kuò)散系數(shù)值（apparent diffusion coefficient，ADC）及擬合出ADC圖。根據(jù)參考文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]利用10個(gè)b值擬合出ADC10b圖，再分別提取3個(gè)低b值（0 s/mm2、50 s/mm2、100 s/mm2）擬合出ADClow圖，提取3個(gè)高b值（500 s/mm2、750s/mm2、1000 s/mm2）擬合出ADChigh圖，根據(jù)0 s/mm2、500 s/mm2、1000 s/mm2擬合出ADC3b圖。腫瘤組織ROI包括整個(gè)腫瘤組織，忽略腫瘤組織內(nèi)的壞死區(qū)。各ADC圖的ROI大小及位置一致。將ADClow與ADChigh值之間的差異定義為ADCperf值。

3. 組織病理學(xué)檢查

裸鼠皮下腫瘤組織以10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片進(jìn)行常規(guī)HE染色及微血管密度測定（M VD）、血管內(nèi)皮生長因子強(qiáng)度表達(dá)(VEGF)及增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）檢測。

4. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同治療組間、同一組治療不同時(shí)期的多b值DWI檢查獲得的各項(xiàng)觀察指標(biāo)行重復(fù)測量的方差分析。各觀察指標(biāo)與病理結(jié)果之間進(jìn)行相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取a =0.05。

結(jié) 果

1. 藥物治療前后移植瘤體積變化結(jié)果

移植瘤體積在三組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=8.543，P﹤0.01），且不同觀察時(shí)相的變化趨勢是不同的（F=32.952，P﹤0.01）。藥物治療后24h及48h，腫瘤體積增長速度減低（圖1），分別與對照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P﹤0.05），兩藥物組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.870；P=0.511)。

2．DWI圖像及各ADC圖的圖像特點(diǎn)

各組治療前后的各類ADC圖上移植瘤均呈稍低信號，其中ADChigh圖的圖像信噪比較差，病灶顯示不清楚，而ADC10b圖信噪比較高，腫瘤邊界顯示較清楚。藥物治療前及治療后1h的ADC圖上移植瘤信號較均勻，兩組藥物治療后24h及48h的ADC圖上信號強(qiáng)度顯示不均勻，可見斑片狀及斑點(diǎn)狀高信號的液化壞死區(qū)（ 圖2）。

3.多b值DWI各參數(shù)的測定結(jié)果

三組移植瘤藥物治療前后多b值DWI中各定量參數(shù)的變化趨勢見圖3。ADC3b、ADC10b、ADChigh值在三組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=11.877，F(xiàn)=9.870，F(xiàn)=8.511，P﹤0.01），ADClow及ADCperf值在三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.345，P=0.277；F=1.702，P=0.201）。每個(gè)觀察時(shí)間段三組間的比較顯示治療前無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在治療后1h時(shí)，兩藥物組ADC3b、ADC10b、ADClow及ADCperf值低于對照組；在治療后24h及48h時(shí)，ADC3b及ADC10b值高于對照組，而抗腫瘤血管藥物組的ADCperf及ADClow值在治療后24h時(shí)低于其余兩組。各觀察指標(biāo)不同觀察時(shí)相的變化趨勢是不同的（F=66.036，F(xiàn)=65.698，F(xiàn)=19.9，F(xiàn)=83.587，F(xiàn)=38.780，P﹤0.01）。兩藥物組ADC3b、ADC10b、ADChigh值在治療后1h明顯減低，治療后24h明顯升高；ADClow及ADCperf值在細(xì)胞毒性藥物治療后24h開始恢復(fù)，而在抗腫瘤血管藥物治療后24h時(shí)持續(xù)下降。

4. 病理免疫組化結(jié)果與多b值DWI各參數(shù)間的相關(guān)性分析

多b值DWI各觀察指標(biāo)與免疫組化間的相關(guān)性分析結(jié)果見表1。ADC3b及ADC10b分別與M VD計(jì)數(shù)、VEGF強(qiáng)度表達(dá)及PCNA計(jì)分呈負(fù)相關(guān)性，ADCperf值與上述免疫組化結(jié)果呈正相關(guān)性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而ADClow值與M VD計(jì)數(shù)及VEGF計(jì)分呈正相關(guān)性，ADChigh值與PCNA計(jì)分具有負(fù)相關(guān)性。

圖1 三組移植瘤體積變化結(jié)果，顯示藥物治療后24h及48h，移植瘤體積增長速度減慢，低于對照組。

表1 免疫組化結(jié)果與多b值DWI各定量參數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果

圖2 抗腫瘤血管藥物治療前后ADC10b圖上移植瘤信號強(qiáng)度的變化。A.為治療前、B.為治療后1h、C.為治療后24h、 D.為治療后48h；藥物治療前以及治療后1h移植瘤信號較均勻，治療后24h及48h移植瘤內(nèi)部可見斑片狀稍高信號的液化壞死區(qū)。

圖3 三組移植瘤藥物治療前后多b值DWI中各定量參數(shù)的變化趨勢。藥物治療前各ADC值組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在治療后1h時(shí)，兩藥物組ADC3b、ADC10b、ADClow及ADCperf值低于對照組；在治療后24h及48h時(shí)，ADC3b及ADC10b值高于對照組，而抗腫瘤血管藥物組的ADCperf及ADClow值在治療后24h時(shí)低于其余兩組。

討 論

1.DWI可定量反映抗腫瘤血管藥物治療后的早期變化

磁共振彌散加權(quán)成像（diffusion weighted imaging，DWI）通過提供DWI圖像、ADC圖及ADC值多種分析手段從細(xì)胞分子水平早期反映惡性腫瘤放化療后腫瘤內(nèi)部的變化，在無創(chuàng)性評價(jià)腫瘤早期療效方面具有無可比擬的優(yōu)勢。學(xué)者們已研究證實(shí)乳腺癌等惡性腫瘤化療4d后ADC值的升高即表示惡性腫瘤治療有效[9-10]。隨著抗腫瘤血管藥物的研發(fā)，國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為DWI技術(shù)可以作為生物標(biāo)記物早期有效地反映抗腫瘤血管藥物治療后所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而間接反映腫瘤血管關(guān)閉情況。本研究結(jié)果顯示常規(guī)化療藥物及抗腫瘤血管藥物治療后1hDW I各定量參數(shù)即刻發(fā)生了變化，而在治療后2d才表現(xiàn)為腫瘤體積增長率減緩，表明DWI均可實(shí)時(shí)無創(chuàng)性的定量記錄抗腫瘤血管藥物及常規(guī)化療藥物治療后腫瘤的早期變化。

2. 多b值DWI技術(shù)中ADC10b、ADC3b、ADChigh值的作用

影響ADC值大小的因素有腫瘤細(xì)胞密度、組織間隙、組織灌注狀態(tài)、細(xì)胞膜通透性等，其中高b值的ADC值主要由腫瘤細(xì)胞的密度決定，而低b值的ADC值主要受組織血流灌注狀態(tài)決定[1]，因此本研究根據(jù)不同側(cè)重點(diǎn)擬合出ADChigh、ADClow及ADCperf值等定量參數(shù)。研究結(jié)果顯示兩藥物組治療后1h各ADC值均明顯下降，分析原因認(rèn)為細(xì)胞毒性藥物具有殺傷循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤血管形成的作用，注藥后因缺血缺氧而導(dǎo)致細(xì)胞毒性水腫[11]。藥物治療后24h，兩藥物組的ADC3b、ADC10b、ADChigh值均升高，認(rèn)為藥物使腫瘤細(xì)胞壞死、密度下降，組織間隙水分子自由運(yùn)動增加所致。由此可見上述三個(gè)參數(shù)的減低及恢復(fù)主要跟細(xì)胞毒性水腫的出現(xiàn)以及細(xì)胞密度的減低、組織間隙的增加有關(guān)。且上述定量參數(shù)與PCNA計(jì)分具有負(fù)相關(guān)性，認(rèn)為這三個(gè)定量參數(shù)可以反映腫瘤的細(xì)胞代謝情況，其中 ADChigh值能更好反映藥物治療后細(xì)胞膜滲透性的改變、細(xì)胞的腫脹及細(xì)胞的早期裂解，這與Yiftach研究結(jié)果一致[12]。同時(shí)，ADC10b值及ADC3b值仍與MVD及VEGF染色呈負(fù)性相關(guān)，表明其值的升高在一定程度上可以間接反映藥物治療后腫瘤血管的關(guān)閉情況。

3. 多b值DWI技術(shù)中ADClow、ADCperf值的作用

ADClow及ADCperf值在不同作用機(jī)制藥物治療后24h時(shí)的變化趨勢不一致，表明ADClow及ADCperf值主要反映了腫瘤微循環(huán)灌注狀態(tài)。這兩個(gè)參數(shù)的變化可以區(qū)分不同作用機(jī)制藥物的早期反應(yīng)，有望為藥物作用機(jī)制的分析提供研究平臺。但ADClow值受以下幾個(gè)不同權(quán)重因素的影響，如擴(kuò) 散、微循環(huán)和組織結(jié)構(gòu)，個(gè)人或群體間測量的比較可重復(fù)性較差[13]。而ADCperf值比較符合血流灌注情況，且該值與免疫組化染色均呈正相關(guān)，認(rèn)為ADCperf值的增高和減低可以大致反映腫瘤微循環(huán)血流灌注的增加和下降，并且間接反映了腫瘤細(xì)胞的增殖活性，因此當(dāng)無法建立靜脈通道做DCE-MRI檢查時(shí)，ADCperf值可以用來近似替代反映腫瘤的血液灌流情況。

由此可見，多b值DWI各參數(shù)可作為影像學(xué)生物標(biāo)記物反映活體組織中水分子的擴(kuò)散運(yùn)動能力及腫瘤血流灌注情況以評價(jià)抗腫瘤治療的早期變化，且可成為評估抗腫瘤血管藥物治療后血管關(guān)閉及細(xì)胞代謝情況的輔助參考指標(biāo)?？傊?，多b值DWI技術(shù)因具有無創(chuàng)、簡便等優(yōu)勢，可成為靶向治療療效評價(jià)中較有價(jià)值的 MRI 功能成像技術(shù)之一。

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