趙永明,王書華,劉澤華,崔生林

(河北北方學院1.藥學系;2.公共體育部,張家口 075000)

正交實驗法優(yōu)化款冬花中槲皮素的提取工藝*

趙永明1,王書華1,劉澤華1,崔生林2

(河北北方學院1.藥學系;2.公共體育部,張家口 075000)

目的 建立款冬花中槲皮素的酸水解方法,并測定槲皮素含量。方法款冬花粉末經脫脂后,用80%乙醇超聲提取,并濃縮干燥。通過單因素考察和正交實驗,確定槲皮素的最佳水解條件。結果最佳水解條件為,60倍量濃度為36%鹽酸溶液,80℃水浴加熱水解70min。結論該水解方法操作簡便,結果準確可靠。

款冬花;槲皮素;正交實驗法

款冬花為菊科款冬屬植物款冬(Tussilago farfara L.)的干燥花蕾,具有潤肺下氣、止咳化痰的功效。臨床上主要用于新久咳嗽、咳喘痰多、勞嗽咳血[1]?？疃ㄖ饕瘜W成分為黃酮類、生物堿、倍半萜和三萜類等[2-3]。黃酮化合物常見的有蘆丁、槲皮素、山柰酚、金絲桃苷、橙皮苷等[4]。其中槲皮素具有抗病毒,抗炎作用和心血管保護等作用[5-7],但本植物中槲皮素多以苷的形式存在,如蘆丁、槲皮苷、金絲桃苷等,而游離型的槲皮素濃度很低。筆者通過單因素考察和正交實驗,確定槲皮素提取時的最佳水解條件,以高效液相色譜法測定槲皮素的含量,為款冬花的進一步開發(fā)利用提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DZF-020型真空干燥箱(寧波江南儀器廠),KQ-300VDB型雙頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),AX205DR精密天平(上海恒科科技有限公司),Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

1.2 試藥 款冬花購于河北安國,經河北北方學院中醫(yī)學院趙恒成教授鑒定為菊科款冬屬植物款冬(Tussilago farfaraL.)的干燥花蕾;槲皮素(中國食品藥品檢定研究院,批號:10129905,含量96.5%)。乙腈為色譜純(阿達瑪斯,上海)。

2 方法與結果

2.1 槲皮素含量的測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18柱 (4.6 mm×200 mm,5μm);流動相為乙腈-水(77∶23),體積流量1.0 mL·min-1;檢測波長365 nm;進樣體積20μL[8-10]。色譜見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的槲皮素對照品適量,加甲醇制成濃度為0.128 mg·mL-1的對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 將款冬花粉碎,石油醚浸泡24 h后回流脫脂,然后以10倍量80%乙醇超聲提取2次(功率200 W,頻率40 kHz,溫度30℃),每次0.5 h,合并提取液,濃縮至半固體,置于培養(yǎng)皿中放入真空干燥箱中干燥,稱定質量,備用。精密稱定該提取物(相當于款冬花藥材1 g),加鹽酸-甲醇溶液水浴加熱30 min,水浴完畢后迅速冷卻至室溫。取水解液1 m L置于25 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,即得。

圖1 槲皮素對照品(A)與款冬花水解物(B)高效液相色譜圖

2.1.4 線性關系考察 精密吸取槲皮素對照品儲備液適量,加甲醇稀釋,制成濃度分別為1.60,3.20, 6.40,12.80,32.0,64.0μg·mL-1的對照品溶液,注入高效液相色譜儀,測定峰面積。以峰面積(Y)對濃度(C)進行線性回歸,回歸方程為:Y=3 268.7C+32.47 (r=0.999 6),表明在1.60～64.00μg·mL-1范圍內槲皮素濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.5 精密性實驗 精密吸取濃度12.80μg·mL-1的對照品溶液20μL,連續(xù)進樣6次,結果槲皮素峰面積的RSD為1.46%。

2.1.6 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液,分別于0,1,2,4,6,12 h分別進樣20μL,測定槲皮素峰面積,結果RSD為1.89%,說明供試品溶液在制備后12h內穩(wěn)定。

2.1.7 重復性實驗 精密稱取同一批藥材6份,按“供試品溶液的制備”項下操作,制成供試品溶液,精密吸取20μL進樣,測定,槲皮素含量的RSD為2.67%,表明方法重復性較好。

2.1.8 加樣回收率實驗 精密稱取已測定的款冬花藥材適量,共6份,加入槲皮素對照品,按樣品溶液制備項下制備供試品溶液,分別測定各樣品的峰面積,計算平均回收率為101.4%,RSD為2.14%。

2.2 槲皮素水解條件的考察

2.2.1 酸濃度考察 精密稱定約0.1 g款冬花乙醇提取物,分別加入60倍量的16%,20%,24%,28%, 32%,36%鹽酸溶液,加甲醇至20mL,封口,60℃時水浴30 min。水浴完畢后冷卻至室溫。取1 mL水解液于25 mL量瓶中,甲醇定容,注入高效液相色譜儀測定峰面積,計算槲皮素含量,結果槲皮素含量分別為0.85%,1.46%,1.97%,2.53%,2.77%,2.71%。槲皮素含量隨著酸濃度的增加而增大,32%鹽酸水解時達到最大值。

2.2.2 酸用量考察 精密稱定款冬花乙醇提取物約0.1 g,分別加入20,40,60,80,100倍量32%鹽酸,加甲醇至20 mL,封口,60℃時水浴30 min。水浴完畢后冷卻至室溫。取1 mL水解液于25 mL量瓶中,甲醇定容,注入高效液相色譜儀測定峰面積,計算槲皮素含量。結果槲皮素含量分別為0.64%,0.93%,2.81%, 3.26%,3.12%,顯示鹽酸用量為80倍量時,槲皮素含量最高,用量過高或過低都不增加槲皮素含量,故鹽酸用量選擇80倍量。

2.2.3 水解時間考察 精密稱定款冬花乙醇提取物約0.1 g,加入80倍量32%鹽酸,加甲醇至20 m L。封口,60℃時水浴30,50,70,90,110 min。水浴完畢后冷卻至室溫。取1 mL水解液于25 mL量瓶中,甲醇定容,注入高效液相色譜儀測定峰面積,計算槲皮素含量。結果槲皮素含量分別為3.25%,4.18%,4.49%, 4.33%,4.16%,顯示水解時間為70 min時,槲皮素含量最高。

2.2.4 水解溫度考察 精密稱定款冬花乙醇提取物約0.1 g,加入80倍量的32%鹽酸,加甲醇至20 mL。封口,在40,60,80,100℃水浴溫度下,水解70 min。水浴完畢后冷卻至室溫。取1 mL水解液于25 mL量瓶中,甲醇定容,注入高效液相色譜儀測定峰面積,計算槲皮素含量。結果槲皮素含量分別為4.02%, 4.49%,5.13%,4.87%,顯示水浴溫度為80℃時,槲皮素含量最高。

2.3 正交實驗設計 結合單因素考察實驗結果,選擇酸濃度、酸用量、水解時間和水解溫度為影響因素,各因素選定3個水平,按L9(34)表進行實驗,計算槲皮素含量。正交實驗安排及結果、方差分析結果分別見表1～3。

表1 L9(34)因素水平表

表2 槲皮素水解工藝正交實驗安排與結果

表3 方差分析結果

直觀分析發(fā)現(xiàn)各因素對槲皮素水解的影響次序依次為A＞D＞C＞B,方差分析顯示因素A(酸濃度)和D (水解溫度)對槲皮素水解差異有統(tǒng)計學意義。結合極差分析和方差分析結果認為最佳水解工藝為A3D2C2B1,即36%鹽酸,用量為60倍量,80℃時水解70 min。

2.4 驗證實驗 精密稱取款冬花乙醇提取物約0.1 g共3份,按照正交實驗中的最佳實驗條件,即用60倍量濃度為36%的鹽酸溶液,80℃時水解70 min,測定槲皮素的量。結果槲皮素的含量分別為9.63%,9. 48%和9.54%。按此最佳條件水解款冬花提取物時,槲皮素含量穩(wěn)定,工藝切實可行。

3 討論

本實驗先用石油醚脫脂,然后進行提取,可以消除脂類成分對后續(xù)測定工作的干擾。

在款冬花的提取過程中,分別比較回流提取法和超聲提取法,結果發(fā)現(xiàn)超聲提取法所得槲皮素含量要高于回流法;另外超聲提取時溫度低,可以減少熱敏性有效成分的損失。

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DOI 10.3870/yydb.2014.06.031

R284.2;TQ460.6

A

1004-0781(2014)06-0800-03

2013-07-11

2013-08-13

*河北北方學院校級課題(2010029)

趙永明(1978-),女,河南汝南人,講師,碩士,從事中藥研究開發(fā)。電話:0313-4029305,E-mail:zym2167@163.com。

崔生林(1973-),男,河北張家口人,講師,從事運動恢復研究。電話:(0)18932731386,E-mail:shenglincui@126.com。