郭秋平，楊 威，郭 琳，覃仁安，金若敏

藥物性肝損傷（drug induced liver injury，DILI）對患者的健康具有重要影響，DILI會影響藥物在臨床的使用，甚至藥物撤市。對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是臨床常用藥物，其肝毒性已有大量的報道［1－3］，APAP常用劑量小于2 g·d－1，若大于 4 g·d－1，可致肝損害，大于 10 g·d－1可致死亡。因此，美國食品藥品管理局（FDA）要求生產(chǎn)廠家修改藥品說明書，標明過量應用APAP可導致肝臟毒性反應。

肝細胞色素P450在藥物代謝中起著重要的作用。細胞色素酶P450廣泛分布于哺乳動物的組織器官中，其中，肝臟和腸管含量最高［4］。約有20種細胞色素酶P450參與藥物的代謝，如果代謝某種藥物的酶缺乏或受抑制時，可表現(xiàn)為該藥物的血藥濃度升高，半衰期延長，導致毒性反應增加［5］。

本研究通過對SD大鼠P450的檢測，并結(jié)合APAP的毒代動力學結(jié)果，分析藥物的毒性及體內(nèi)的蓄積情況，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理 SD♀♂大鼠，體質(zhì)量200～240 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。將大鼠分為4組，即陰性對照組、APAP 189、567 mg·kg－1組以及肝細胞色素P450抑制劑西咪替丁組。每天給藥1次，連續(xù)14 d，陰性對照組給予超純水。

1.2 藥物及主要試劑 APAP：廣州白云山制藥股份有限公司白云山何濟公制藥廠提供，批號：20120801；APAP標準品：中國食品藥品檢定研究院提供，批號：100018－200408；西咪替丁片：廣東臺城制藥有限公司，批號：20130202。

1.3 方法

1.3.1 毒代動力學研究

1.3.1.1 血漿樣品采集和前處理 給藥d 1、7、14，于給藥0、0.25、0.5、1、2、4、8、12 h眼眶采集 0.5 ml全血，肝素抗凝，2 000×g離心，取上層血漿。取血漿0.2 ml，加入1.2 ml乙醚，渦旋2 min，2 000×g離心，取上層有機相1 ml于另一離心管。40℃水浴，氮氣吹干，殘渣用100μl純水溶解，取30 μl進樣。

1．3.1.2 方法學驗證 高效液相色譜法測定。色譜條件：色譜柱：迪馬 diamosil 250 mm×4.6 mm（5μm）。柱溫：25℃。流動相：水（1%三乙胺）∶乙腈＝90∶10。流速：1.0 ml·min－1。檢測波長：245 nm。進樣量：20μl。

1.3.1.2.1 專屬性考察 取6只大鼠的空白血漿樣品，加入APAP對照品，按照血漿處理方法處理?？疾炜瞻籽獫{樣品在APAP出峰時間是否有雜質(zhì)干擾，方法專屬性是否良好。

1.3.1.2.2 線性 配制濃度為1 g·L－1的母液，分別稀釋為 1 000、500、250、100、50、25、10 mg·L－1系列濃度的標準溶液。取以上系列濃度各20μl，加入空白血漿，配制成為終濃度 100、50、25、10、5、2.5、1 mg·L－1血漿工作曲線，按血漿樣品處理方法處理。

1.3.1.2.3 精密度及準確度試驗 精密度用質(zhì)控樣品的批內(nèi)和批間相對標準差（RSD%）表示。取0.18 ml空白血漿，加入20μl APAP，配制成終濃度為 100、25、5 mg·L－1的血漿樣品，每個濃度5個樣品。精密度相對標準差應小于15%，在定量下限附近相對標準差應小于20%。準確度應在85%～115%范圍內(nèi)，在定量下限附近應在80%～120%范圍內(nèi)。

1.3.1.2.4 回收率試驗 配制APAP終濃度為5、25、100 mg·L－1的血漿樣品，按血漿樣品處理方法進行提取。提取后，檢測血漿樣品中APAP的響應值，回收率計算方法為測定所得APAP的響應值／血漿中已知量APAP的理論值×100%，回收率應在80%～120%范圍內(nèi)。

1.3.1.3 質(zhì)量控制及樣品檢測 配制終濃度為5、25、100 mg·L－1的血漿樣品，經(jīng)前處理后平均分布于所有待測樣品中，QC樣品總數(shù)不少于5%。每日隨行標準曲線和QC樣品。

1.3.2 P450檢測 給藥14 d后，稱取2 g左右的肝臟，加入10 ml勻漿緩沖液或TMS緩沖液，將肝臟剪成細小碎塊，用玻璃勻漿器制成20%肝臟勻漿。

1.3.2.1 S9和肝臟微粒體的制備 將肝勻漿液2℃12 000×g高速離心20 min，所得上清液即線粒體后上清液。取適量線粒體后上清液，CaCl2沉淀法制備肝微粒體。每1 ml加入0.1 ml 88 mmol·L－1CaCl2溶液混勻，冰浴 5 min，2℃27 000×g離心15 min。棄上清，所得微粒體用Tris緩沖液清洗，沉淀用磷酸緩沖液重懸。

1.3.2.2 微粒體蛋白含量和細胞色素P450光譜測定 采用考馬斯亮藍試劑盒測定微粒體蛋白含量。光譜法測定細胞色素 P450：測定蛋白含量后，用 Tris緩沖液稀釋成10 g·L－1的蛋白懸液。取蛋白懸液0.3 ml，加Tris緩沖液5.7 ml混合，加入適量連二亞硫酸鈉，分裝于兩個比色杯，一為空白杯，另一為樣品杯，通入CO，1～2氣泡／s，2 min。分別于490及450 nm測定差示光譜。P450計算公式：

1.4 統(tǒng)計學處理 毒代動力學參數(shù)采用DAS 2.0軟件進行計算，結(jié)果應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料的平均值用xˉ±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 毒代動力學檢測結(jié)果

2.1.1 專屬性考察結(jié)果 對乙酰氨基酚保留時間為5.8 min，血漿中雜質(zhì)不干擾APAP的測定，該方法具有較高的專屬性。

2.1.2 血漿工作曲線 血漿工作曲線在1～100 mg·L－1范圍內(nèi)線性良好，Y＝2．20e4x－4．74e3r2＝0.997；定量下限為1 mg·L－1。

2.1.3 精密度和準確性試驗結(jié)果 d 1、2、3，日內(nèi)精密度RSD分別為2.7%～10.7%、2.7%～7.2%、1.2%～8.4%，3 d的日內(nèi)精密度RSD為1.2%～10.7%，日間精密度RSD 2.2%～3.5%，均小于15%，符合要求。日間準確度0.30%～10.00%。結(jié)果見Tab 1、2。

Tab 1 Precision test results of intra day（n＝5）

Tab 2 Precision test results of three days（n＝5）

2.1.4 回收率試驗結(jié)果 100、25、5 mg·L－1的血漿回收率分別為 98.4%、88.6%、93.8%，回收率為 88.6% ～98.4%，在80%～120%之間，符合要求。

方法學考察結(jié)果顯示專屬性良好，在1～100μg·L－1范圍內(nèi)線性良好，定量下限為1 mg·L－1，精密度、準確度和回收率均達到要求，表明本方法可靠，可用于血漿樣品的檢測。

2.1.5 樣品測定結(jié)果 主要藥代動力學參數(shù) AUC（0－t）、Cmax、Tmax。其中，AUC（0－t）由梯形法計算得到，Cmax、Tmax均以實測值表示。

APAP 189 mg·kg－1組給藥 d 1、7、14，AUC（0－t）分別為（208.6±63.7）、（150.9±102.4）、（214.8±78.5）mg·L－1·h；Cmax分別為（119.0±43.7）、（121.9±92.7）、（90.4±18.7）mg·L－1；Tmax分別為（0.4±0.3）h、（2.2±1.0）h、（0.6±0.7）h。APAP 567 mg·kg－1組給藥 d 1、7、14，AUC（0－t）分別為（783.6±163.1）、（982.3±317.9）、（1313.9±189.5）mg·L－1·h；Cmax分別為（161.2±43.4）、（209.0±116.3）、（259.3±51.7）mg·L－1；Tmax分別為（1.5±1.8）h、（1.4±1.4）h、（2.0±0.0）h。

APAP 567 mg·kg－1組給藥 d 14，AUC（0－t）、Cmax明顯增加，與給藥d 1相比，差異有顯著性（P＜0.05），提示藥物產(chǎn)生了蓄積。

2．2 P450檢測結(jié)果 給藥14 d后，P450抑制劑西咪替丁組P450明顯降低，論證了本試驗系統(tǒng)合格。對乙酰氨基酚組P450含量降低，與陰性對照組相比，APAP 567 mg·kg－1P450含量降低，差異有顯著性，結(jié)果見Tab 3。

Tab 3 APAP influence on the content of P450（ˉx±s，n＝6）

3 討論

APAP大鼠毒代動力學研究結(jié)果表明，在劑量567 mg·kg－1時，給藥14 d后，藥物在體內(nèi)產(chǎn)生了蓄積，對P450的總量也產(chǎn)生了抑制作用，推測P450代謝APAP的功能減弱，使藥物在體內(nèi)產(chǎn)生了蓄積。

目前，雖然APAP藥代動力學的研究很明確，但通過本文的研究得出，APAP大劑量使用一段時間后，會產(chǎn)生抑制P450的作用，并引起藥物在體內(nèi)的蓄積，加劇藥物毒性。

參考文獻：

［1］ Amar P J，Schiff E R.Acetaminophen safety and hepatotoxicitywhere do we go from here［J］？Expert Opin Drug Saf，2007，6（4）：341－55.

［2］ Shayiq R M，Roberts D W，Rothestein K，et al.Repeat exposure to incremental doses of acetaminophen provides protection against acetaminophen induced lethality in mice［J］．Hepatology，1999，29（2）：451－63.

［3］ Fannin RD，Russo M，O′Connell T M，et al.Acetaminophen dosing of humans results in blood transcriptom and metabolome changes consistent with impaired oxidative phosphorylation［J］.Hepatology，2010，51（1）：227－36.

［4］ Koop D R.Oxidative and reductive metabolism by cytochrome P450 2E1［J］.FASEB J，1992，6（2）：724－30.

［5］ Koster U，Speerschneider P，Kerssebaum R，et al.Role of cyctochrome P4502E1 in themetabolism of 1，1，2，2，32 hexafluoropropylmethylether［J］.Drug Metab Dispos，1994，22（5）：667－72.