張 松，朱 琳，郝 軍，鄭書深

糖尿病腎病是危害糖尿病病人生命的重要并發(fā)癥之一［1］，其發(fā)生涉及高血流灌注、氧化應(yīng)激［2］、糖基化末端產(chǎn)物、高血糖［3］、高胰島素和血脂異常等。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腎組織均出現(xiàn)脂滴積聚，進(jìn)一步證實(shí)脂質(zhì)積聚在糖尿病腎病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［4］。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element binding protein-1，SREBP-1）是1993年首次從體外培養(yǎng)的人HeLa細(xì)胞核抽提物中純化出來的，該蛋白屬于螺旋－環(huán)－螺旋－亮氨酸鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族，其在脂質(zhì)代謝中起著重要調(diào)節(jié)作用，其高表達(dá)往往激活脂質(zhì)合成相關(guān)的酶基因，引起脂肪酸、甘油三酯的合成增多［5］。脂肪分化相關(guān)蛋白（adipose differentiation related protein，ADRP）是一種重要的脂滴表面蛋白，也是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的特征性指標(biāo)［6］。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯脂滴，脂質(zhì)代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1明顯上調(diào)并伴有脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）的升高；進(jìn)一步的體外研究又證實(shí)，給予人腎小管上皮細(xì)胞高糖刺激可上調(diào)SREBP-1，進(jìn)而增加 FASN和乙酰輔酶 A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase，ACC）的表達(dá)［7］，細(xì)胞內(nèi)脂滴增多，提示高糖是糖尿病導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)積聚的原因之一，然而是否還有其他因素也參與其中還未完全闡明。

細(xì)胞因子已被證實(shí)參與了糖尿病的發(fā)生發(fā)展［8］，其中腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是其中重要的細(xì)胞因子。有研究揭示：TNF-α在肝細(xì)胞［9］和皮脂腺細(xì)胞中［10］，均可上調(diào)SREBP-1表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚。然而，TNF-α是否參與了糖尿病腎臟脂質(zhì)積聚還未見報(bào)道，因此，本課題組擬構(gòu)建糖尿病小鼠模型，檢測血清中TNF-α和腎臟脂質(zhì)的含量，明確二者之間的關(guān)系。對于闡明糖尿病腎臟脂質(zhì)積聚的機(jī)制有重要意義，也為將來的臨床治療提供可靠的靶點(diǎn)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料 SREBP-1抗體（可同時(shí)識(shí)別SREBP-1a和SREBP-1c）和 β-actin抗體購自于 Epitomics公司，ADRP抗體購自Santa Cruz公司。鏈脲佐菌素購自Sigma公司。SP法免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB購自北京中杉金橋試劑公司?？剐∈骉NF-αELISA試劑盒購自欣博盛公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型構(gòu)建 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用CD1小鼠，擬分為以下兩組：對照組和糖尿病組，每組7只。糖尿病模型采用腹腔注射鏈脲佐菌素150 mg·kg－1體重（streptozotocin，STZ，溶于 0.1 mol·L－1枸櫞酸鹽緩沖液中，pH值4.5），對照組只注射相當(dāng)體積的枸櫞酸鹽緩沖液，72 h后，空腹血糖大于16.7 mmol·L－1者確定為1型糖尿病模型。每周檢測血糖，剔除血糖恢復(fù)的小鼠（2只）。喂養(yǎng)1個(gè)月后，水合氯醛麻醉小鼠，眼球摘除取血，并處死動(dòng)物切取腎臟。全血室溫放置約1 h后3 000 r·min－1離心10 min，收集血清；腎臟切取皮質(zhì)，部分置于中性福爾馬林固定，制作石蠟切片，部分液氮速凍后－70℃冰箱保存。

1.2.2 ELISA ELISA方法檢測正常和糖尿病小鼠血清的TNF-α水平。從冰箱中取出預(yù)包被的酶標(biāo)板，平衡至室溫，空白孔加通用稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（0、15.6、31.25、62.5、125、250、500和 1 000 ng·L－1），樣品孔加待測的樣品100μl，封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃ 孵育90 min，后續(xù)步驟參照說明書進(jìn)行，最后酶標(biāo)儀上測量每個(gè)孔的OD450值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品的TNF-α濃度。

1.2.3 免疫組織化學(xué) 采用SP法，以PBS代替一抗作陰性對照。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)后3%過氧化氫室溫孵育20 min，血清37℃封閉30 min，一抗（1∶100稀釋），37℃孵育 2 h，PBS洗 3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min，PBS洗3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素37℃孵育30 min，PBS洗3次，DAB顯色、蘇木精復(fù)染、分化、返藍(lán)、脫水封片。

1.2.4 Western blot 腎組織塊加入10倍體積的冰冷裂解液，經(jīng)研磨后置于EP管中，4℃、12 000 r·min－1離心20 min，吸取上清，考馬斯亮藍(lán)法測定上清液蛋白濃度。每孔加80μg總蛋白，經(jīng)7.5%SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%BSA封閉，一抗（1∶1 000稀釋）4℃過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育2 h；滴加ECL發(fā)光試劑，在暗室中壓片、顯影和定影。條帶分析使用Gel-Pro analyzer軟件，目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin條帶的積分光密度（integrated optical density，IOD）比值作為相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2．1 糖尿病小鼠血清中TNF-α明顯升高 正常CD1小鼠血糖平均值為11.3 mmol·L－1，糖尿病小鼠的血糖平均值為30.78 mmol·L－1。ELISA檢測顯示正常對照小鼠血清TNF-α濃度平均為31.05 ng·L－1，糖尿病小鼠血清TNF-α濃度平均為240 ng·L－1。相比于正常對照組小鼠，糖尿病小鼠的血清TNF-α升高了大約7.73倍，經(jīng)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fig 1）。

Fig 1 Serum TNF-αconcentration of normal and diabetic mice

2．2 糖尿病小鼠腎臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因SREBP-1和ADRP明顯升高 免疫組織化學(xué)檢測顯示，糖尿病小鼠腎臟SREBP-1和ADRP表達(dá)主要定位于腎小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)，呈明顯的棕黃色，顆粒狀，而正常小鼠腎臟僅見少量腎小管上皮細(xì)胞有棕黃色顆粒（Fig 2）。

Fig 2 SREBP-1 and ADRP expression in kidney of normal control mice and diabetic mice by immunohistochemistry（×400）

Western blot檢測結(jié)果見Fig 3，糖尿病小鼠腎臟SREBP-1前體片段、成熟片段和ADRP均明顯升高，分別是正常小鼠的2.31倍、1.74倍和1.72倍，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

Fig 3 Expression of SREBP-1 and ADRP in kidney of normal control mice and diabetic mice by Western blot

2．3 小鼠血清TNF-α含量和腎臟ADRP表達(dá)呈正相關(guān) 采用Pearson相關(guān)分析對小鼠血清TNF-α含量和腎臟ADRP表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果證實(shí)在正常小鼠和糖尿病模型小鼠，隨著血清中TNF-α含量的增加，腎臟ADRP表達(dá)也明顯增強(qiáng)，二者經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示有正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.914，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fig 4）。

3 討論

糖尿病是一種以血糖升高為臨床特征的慢性疾病，并發(fā)癥的出現(xiàn)嚴(yán)重危害人類健康，其中糖尿病腎病以腎臟高血流灌注、系膜細(xì)胞增生肥大、腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及腎間質(zhì)纖維化為特征，可導(dǎo)致腎功能不全，甚至引起患者死亡。研究揭示多種因素參與了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展，例如：高血糖、高血脂、糖基化終末產(chǎn)物、細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激。近年來，不斷有研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及糖尿病患者腎臟出現(xiàn)脂質(zhì)積聚，在系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多的脂滴。然而，具體的機(jī)制還未闡明［11］。

Fig 4 Correlation analysis between serum TNF-α and renal ADRP in mice

大量的研究已證實(shí)，免疫及炎癥反應(yīng)在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。糖尿病腎病可看作一種由代謝紊亂引起的炎癥性疾?。?2］。炎癥因子可通過旁分泌和自分泌方式發(fā)揮病理生理作用，促進(jìn)腎臟細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)分泌和聚積、細(xì)胞肥大等，并且與疾病晚期腎小管間質(zhì)纖維化（tubular interstitial fibrosis，TIF）關(guān)系密切［13］。然而，炎癥因子是否和糖尿病腎臟的脂質(zhì)代謝異常相關(guān)目前尚未見報(bào)道。

腫瘤壞死因子有2種亞型：TNF-α和 TNF-β。TNF-α又被稱為惡質(zhì)素，主要由巨噬細(xì)胞分泌，其在體內(nèi)有兩種存在形式，一種為跨膜型（tmTNF-α），分子質(zhì)量為26 ku；另一種為游離型TNF-α，分子質(zhì)量為17 ku。其中，過多游離型TNF-α?xí)鹨幌盗械难仔愿腥炯白陨砻庖咝约膊。?4］。

本研究揭示糖尿病小鼠血清TNF-α水平明顯升高，這和 Hussain等［15］及 Kayal等［16］的研究相似，他們分別在糖尿病患者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)血清TNF-α的明顯升高。本研究還發(fā)現(xiàn)糖尿病腎臟脂質(zhì)代謝調(diào)控因子SREBP-1和脂滴標(biāo)記物ADRP也明顯高于正常對照小鼠，提示糖尿病狀態(tài)下，高TNF-α可能是引起腎臟脂質(zhì)調(diào)控因子升高的因素之一。進(jìn)一步對血清TNF-α水平和腎臟ADRP之間的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果揭示隨著血清TNF-α的升高，腎臟表達(dá) ADRP也相應(yīng)上調(diào)。相似地，Endo等［9］在小鼠的研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射TNF-α后，很快引起了血清游離脂肪酸升高和肝臟的脂質(zhì)積聚，同時(shí)肝臟脂肪酸合成酶和SREBP-1c mRNA水平的表達(dá)也明顯升高。Choi等［10］在SZ95人皮脂腺細(xì)胞的研究也揭示：TNF-α刺激人皮脂腺細(xì)胞，增加細(xì)胞內(nèi)脂滴形成，同時(shí)伴有脂肪酸合成酶上調(diào)和SREBP-1激活，但對PPARs未產(chǎn)生影響。綜上所述，血清TNF-α升高可能是導(dǎo)致糖尿病腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)積聚的因素。然而，涉及這一調(diào)控的具體機(jī)制還不清楚，有待深入的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Arora M K，Singh U K.Molecular mechanisms in the pathogenesis of diabetic nephropathy：an update［J］.Vascul Pharmacol，2013，58（4）：259－71.

［2］ Chang C C，Chang C Y，Wu Y T，et al.Resveratrol retards progression of diabetic nephropathy through modulations of oxidative stress，proinflammatory cytokines，and AMP-activated protein kinase［J］.J Biomed Sci，2011，18（1）：47.

［3］ 郝 軍，朱 琳，戎贊華，段惠軍.SREBP-1在1型糖尿病大鼠腎臟的表達(dá)和胰島素的干預(yù)性研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（1）：95－9.

［3］ Hao J，Zhu L，Rong Z H，Duan H J.Expression of SREBP-1 in kidney of type 1 diabetic rats and insulin intervention［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（1）：95－9.

［4］ Wang X X，Jiang T，Shen Y，et al.Diabetic nephropathy is accelerated by farnesoid X receptor deficiency and inhibited by farnesoid X receptor activation in a type 1 diabetes model［J］.Diabetes，2010，59（11）：2916－27.

［5］ Bakan I，Laplante M.Connecting mTORC1 signaling to SREBP-1 activation［J］.Curr Opin Lipidol，2012，23（3）：226－34.

［6］ Takahashi K，Sasabe N，Ohshima K，et al.Glucagon regulates intracellular distribution of adipose differentiation-related protein during triacylglycerol accumulation in the liver［J］.J Lipid Res，2010，51（9）：2571－80.

［7］ Jun H，Song Z，Chen W，et al.In vivo and in vitro effects of SREBP-1 on diabetic renal tubular lipid accumulation and RNAimediated gene silencing study［J］.Histochem Cell Biol，2009，131（3）：327－45.

［8］ Liu Q，Liu S，Shi Y，et al.Suppressors of cytokine signaling inhibit tubular epithelial cell-myofibroblast transdifferentiation［J］.Am J Nephrol，2011，34（2）：142－51.

［9］ Endo M1，Masaki T，Seike M，et al.TNF-alpha induces hepatic steatosis in mice by enhancing gene expression of sterol regulatory element binding protein-1c（SREBP-1c）［J］.Exp Biol Med（Maywood），2007，232（5）：614－21.

［10］Choi JJ，Park M Y，Lee H J，et al.TNF-αincreases lipogenesis via JNK and PI3K／Akt pathways in SZ95 human sebocytes［J］.J Dermatol Sci，2012，65（3）：179－88.

［11］Karihaloo A.Anti-fibrosis therapy and diabetic nephropathy［J］.Curr Diab Rep，2012，12（4）：414－22.

［12］Lim A K，Tesch GH.Inflammation in diabetic nephropathy［J］.Mediators Inflamm，2012，2012：146154.

［13］Lewis A，Steadman R，Manley P，et al.Diabetic nephropathy，inflammation，hyaluronan and interstitial fibrosis［J］.Histol Histopathol，2008，23（6）：731－9.

［14］Richter C，Messerschmidt S，Holeiter G，et al.The tumor necrosis factor receptor stalk regions define responsiveness to soluble versus membrane-bound ligand［J］.Mol Cell Biol，2012，32（13）：2515－29.

［15］Hussain G，Rizvi SA，Singhal S，et al.Serum levels of TNF-αin peripheral neuropathy patients and its correlation with nerve conduction velocity in type 2 diabetes mellitus［J］.Diabetes Metab Syndr，2013，7（4）：238－42.

［16］Kayal R A，Siqueira M，Alblowi J，et al.TNF-alpha mediates diabetes-enhanced chondrocyte apoptosis during fracture healing and stimulates chondrocyte apoptosis through FOXO1［J］.J Bone Miner Res，2010，25（7）：1604－15.