李娜娜，劉 銘，耿 越

松花粉具有很高的營養(yǎng)、保健及藥用價值，具有提高機體免疫力、調節(jié)代謝、調血脂和養(yǎng)顏等功效，在國內外已被廣泛地應用于保健品、藥品、化妝品和飼料添加劑等領域［1］。本實驗室前期工作發(fā)現松花粉多糖尤其是其酯化多糖的免疫調節(jié)作用非常明顯［2］。多糖經硫酸酯化修飾后，由于硫酸基團的空間位阻和靜電排斥效應等改變了多糖原來結構，提高了硫酸酯化多糖水溶性，具有抗病毒、抗腫瘤、調節(jié)免疫系統(tǒng)和抗凝血等生物活性［3］。鈣離子是機體中多種生理活動不可或缺的離子，細胞質內鈣離子濃度升高是T細胞被活化引起的最早變化之一［4］。T淋巴細胞內 Ca2＋濃度的上升主要通過CRAC通道來實現［5］，此外還可能通過P2X嘌呤受體［6］、電壓門控的鈣離子通道［7］來介導 Ca2＋內流作用。但目前對硫酸酯化多糖與Ca2＋的關系研究較少，對其作用機制尚不了解，其如何作用于T細胞表面，進而影響胞內鈣離子濃度仍需進一步研究。本實驗分別選用幾種鈣離子信號通路的抑制劑來研究松花粉酯化多糖組分SPPM60-D對小鼠脾臟T淋巴細胞［Ca2＋］i調控的可能信號通路，為馬尾松花粉多糖的實際應用提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑 破壁馬尾松（Pinus massoniana）花粉（破壁率高于95%）由煙臺新時代健康產業(yè)集團提供。水煮醇沉法提取馬尾松花粉粗多糖。三氯乙酸法除蛋白，不同濃度的乙醇分級沉淀，得60%乙醇組分PPM60，Sephacryl S-400HR分離純化得組分D，經氯磺酸-吡啶法硫酸酯化得SPPM60-D，紅外光譜證實酯化成功。硫酸鋇比濁法測定SPPM60-D中硫含量，代入公式后算出取代度為1.202。尼龍毛柱法分離小鼠脾臟T淋巴細胞。

胎牛血清（TBD，天津）；RPMI 1640（Gibco，美國）；2-APB、MTT、U73122、LY294002（Sigma，美國），Fura-2／AM、F127（Dojin，日本）；維拉帕米（verapamil，Ver）注射液（上海禾豐制藥有限公司）；TAK-242（Invitrogen，美國）；小鼠 IL-2、IL-4檢測試劑盒（四正柏生物技術有限公司，北京）；Anti-Mouse-CD3 FITC（eBioscience，美國）；尼龍毛（Kisker，德國）。

1.2 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（NUAIRE，美國），高壓蒸汽滅菌鍋（新華醫(yī)療器械廠），COIC型倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠），熒光分光光度計（Cary E-clipse，美國），5804R離心機（Eppendorf，德國），Stat-Fax-2100型酶聯(lián)免疫檢測儀（Awareness，美國）。

2 方法

2．1 多糖及其酯化多糖對T淋巴細胞增殖的影響常規(guī)方法制備小鼠脾臟細胞后，尼龍毛柱法分離純化小鼠T細胞，臺盼藍染色測定活細胞比率＞93%，細胞液中加入FITC熒光標記的抗小鼠CD3單克隆抗體，用流式細胞儀檢測，T細胞純度達74.6%。用RPMI 1640培養(yǎng)液調整T細胞濃度為2×109個·L－1，分別設置空白對照組、陽性對照組及200 mg·L－1的PPM60-D和SPPM60-D實驗組，MTT法測定T細胞增殖作用。

2．2 T細胞內鈣離子濃度的測定［8］制備2×109個·L－1小鼠脾臟T細胞懸液，在CO2培養(yǎng)箱中預溫5 min后加入終濃度為1 pmol·L－1的 Fura-2／AM，在 37℃恒溫避光孵育45 min，1 000 r·min－1離心5 min后，倒掉上清液，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液沖洗2～3次，實驗組分別加入終濃度為10 mg·L－1的 ConA和 200 mg·L－1的 PPM60-D、SPPM60-D。測定條件：激發(fā)狹縫與發(fā)射狹縫寬度均設為10 nm，發(fā)射波長設為500 nm，用340／380 nm雙波長交替來測定熒光比值。作用5 min后熒光強度比值為R值，隨后加入終濃度為0.1%的Triton X-100破壞細胞膜，此時測定的為最大熒光比值Rmax，5 min時加入EGTA使其終濃度為10 mmol·L－1，測定最小熒光比值Rmin。［Ca2＋］i計算公式如下：

生理條件下，Kd＝224 nmol·L－1，［Ca2＋］i的單位為 nmol·L－1。

2．3 PPM60-D及SPPM60-D與抑制劑對T細胞內［Ca2＋］i的影響 T細胞處理同“2.2”，實驗組分別加入200 mg·L－1的 PPM60-D或 SPPM60-D。抑制劑組分別加入終濃度為1 mg·L－1的TAK-242，終濃度為 20μmol·L－1的 2-APB、LY294002，終濃度為10μmol·L－1的 U73122，終濃度為 10 mg·L－1的維拉帕米（Ver）孵育后，再加入 PPM60-D或SPPM60-D。鈣離子濃度測定同“2.2”。

2．4 PPM60-D及SPPM60-D對T細胞細胞因子產生的影響 取分離的脾臟T淋巴細胞懸液，調細胞密度2×109個·L－1，設置空白對照組，ConA（終濃度 10 mg·L－1）組，PPM60-D及 SPPM60-D（200 mg·L－1）組，TAK-242及 2-APB抑制劑組，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，1 200 r·min－1離心10 min，取上清放入EP管中，－20℃保存?zhèn)溆谩⒄赵噭┖械南嚓P操作步驟檢測上清中的細胞因子。

2.5 統(tǒng)計學處理 實驗數據采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，結果以ˉx±s表示，組間比較采用F檢驗。

3 結果

3．1 對T細胞增殖的影響 如Fig 1所示，用SPPM60-D培養(yǎng)T淋巴細胞48 h后，對T細胞增殖能力明顯高于PPM60-D的作用（P＜0.01）。

Fig 1 Influences of PPM60-D and SPPM60-D on the proliferation of T lymphocytes（48h）（n＝3）

3．2 PPM60-D、SPPM60-D對 T細胞內［Ca2＋］i的影響 與對照組相比，LPS和SPPM60-D分別使T細胞內［Ca2＋］i升高 211.5%、201.8%（Fig 2），而PPM60-D則無明顯作用。

Fig 2 Influences of ConA，PPM60-D and SPPM60-D on［Ca2＋］i level in T lymphocytes（n＝3）

3．3 T細胞鈣離子通路抑制劑對其胞內［Ca2＋］i的影響 結果顯示，TLR-4抑制劑TAK-242對T細胞內［Ca2＋］i并無明顯抑制作用，結果見Fig 3。說明SPPM60-D不是通過TLR-4發(fā)揮作用的。

PI3K的抑制劑LY294002使SPPM60-D促進［Ca2＋］i升高率降為96.1%，抑制率為35%。說明除了PI3K之外還有其他信號分子介導SPPM60-D引起的T細胞內［Ca2＋］i的升高。

另外L-型鈣離子通道的抑制劑Ver、PLC的抑制劑U73122和CRAC通道的抑制劑2-APB都能降低SPPM60-D引起的 T細胞內［Ca2＋］i的升高，升高率與SPPM60-D相比分別降為104.2%、55.1%、48.6%（Fig 3），抑制率分別為 32.3%、48.6%、50.77%。說明SPPM60-D引起的T細胞內鈣離子濃度的升高主要是通過CRAC通道介導的，L-型鈣離子通道也起一定作用，但不是主要通道。

Fig 3 Influences of SPPM60-D on［Ca2＋］i level in T lymphocytes with TAK242／Verapamil／LY294002／U73122／2-APB（n＝3）

3．4 PPM60-D及SPPM60-D對T細胞細胞因子產生的影響 SPPM60-D作用后與對照組相比可使IL-2和IL-4分泌量分別升高6.94倍和5.95倍，且上清中IL-4的濃度要高于IL-2的濃度，而PPM60-D的作用效果不明顯。而加入TLR4的抑制劑TAK-242后，IL-2和IL-4的分泌水平與非抑制劑組相比并無明顯降低，加入CRAC的抑制劑2-APB后，IL-2和IL-4的分泌水平與無2-APB組相比明顯下降（Fig 4、Fig 5），SPPM60-D誘導的細胞因子分泌水平上升與TLR4信號通路關系不大，而受細胞內鈣離子信號通路影響較大。

4 討論

Fig 4 Influences of PPM60-D and SPPM60-D with／without inhibitors TAK242，2-APB on cytokine IL-2 in T lymphocytes supernatant（n＝3）

Fig 5 The influence of PPM60-D and SPPM-D with／without inhibitors TAK242，2-APB on cytokine IL-4 in T lymphocytes supernatant（n＝3）

本實驗室前期關于PPM60和SPPM60兩種多糖對多種細胞內鈣離子濃度的作用做過大量研究。夏瑜等［9］研究發(fā)現SPPM60對離體蟾蜍心臟有正性肌力作用，而維拉帕米可以抑制上述作用，猜測SPPM60的正性肌力作用可能是通過作用于心肌細胞上的L-型鈣離子通道從而增加鈣離子內流實現的。劉媛等［10］研究發(fā)現PPM60明顯抑制心肌細胞內鈣離子濃度的升高，而SPPM60對胞內鈣離子卻有促進作用，用Ver處理，SPPM60的正向作用被抑制。說明PPM60和SPPM60對興奮性細胞的活性影響存在很大區(qū)別，硫酸化修飾可以明顯增強多糖的生物學活性。劉媛等［11］發(fā)現SPPM60能明顯提高小鼠脾細胞胞內鈣離子濃度，提高率達188.4%，而PPM60作用并不明顯，Ver可部分抑制酯化多糖促鈣離子濃度升高的作用。在細胞外液無鈣離子時，IP3R抑制劑低分子肝素（LMWH）可以拮抗SPPM60促進內鈣的釋放；毛華等［8］研究發(fā)現SPPM60-A能明顯提高脾細胞內鈣離子濃度，而Ver和LMWH均可使SPPM60-A促［Ca2＋］i升高率有所降低，除此之外用TLR4、PI3K、PLC的抑制劑分別處理脾細胞，結果對SPPM60-A促［Ca2＋］i升高率都有不同程度的降低，推測鈣離子信號通路為SPPM60A－TLR4－PI3K－PLC－IP3R－Ca2＋。因此我們推測在興奮性細胞中，［Ca2＋］i的上升可能主要是通過L-型鈣離子通道介導的胞內鈣離子濃度的上升，而在非興奮性細胞中，介導［Ca2＋］i升高的通路相對更復雜，除了可能通過L-型鈣離子通道外，還可能通過內鈣釋放引起外鈣內流的方式升高胞內鈣離子濃度。前期工作研究對象是脾臟混懸細胞，本實驗結果顯示，Con-A與SPPM60-D都能明顯升高純化T細胞內［Ca2＋］i。

Song等［12］研究發(fā)現，脂多糖LPS可以通過與膀胱上皮細胞表面Toll樣受體4（TLR4）結合，激活胞內信號通路，促進IL-6的表達。Caramalho等［13］研究表明，TLR4、TLR5、TLR7和 TLR8可以在C57BL／6小鼠CD＋4CD＋25細胞（Treg）表達，有研究發(fā)現調節(jié)性T細胞只占整個CD＋4T細胞的5%－6%［14］。關于小鼠Th1和Th2細胞TLR-4和TLR-2表達情況未見報道。Miao等［15］研究硫酸多糖聚甘古酯（SPMG）對胸腺T淋巴細胞影響時，證明SPMG是通過與T細胞表面的TCR／CD3復合物結合而發(fā)揮作用的。

本實驗選用TLR-4抑制劑TAK-242處理T細胞時，對SPPM60-D增加T細胞內鈣離子濃度沒有明顯作用。進一步證明SPPM60-D與脾臟T細胞的結合不是依賴TLR-4的作用，猜測主要依靠與T細胞表面TCR／CD3復合物的結合而激活細胞內信號通路。

目前對鈣離子內流通路研究發(fā)現主要有以下幾種：鈣離子釋放激活鈣離子通道（Ca2＋release-activated Ca2＋channels，CRAC）、P2X嘌呤受體通道、瞬時受體電位通道、電壓門控鈣離子通道［16］。CRAC通道阻滯劑2-APB可以部分抑制SPPM60-D引起的T細胞內鈣離子濃度的升高。但沒有降到空白水平，說明還有其他通路介導鈣離子內流。

特異性免疫中大多數細胞因子是由活化的 T淋巴細胞產生的，而細胞因子具有調節(jié)天然免疫和適應性免疫，促進造血以及刺激細胞活化、增殖或分化等功能［17］。實驗結果表明，SPPM60-D可以明顯促進IL-2、IL-4的產生，并且這種促進作用與SPPM60-D促進T細胞外Ca2＋大量內流有很大關系，Ca2＋通路可能激活了T細胞相關基因的表達，從而提高了IL-2、IL-4的分泌水平。而這種細胞因子的高水平或許能進一步激發(fā)和促進NK細胞、B淋巴細胞等其他免疫細胞的功能，從而進一步提高整體的免疫功能。

總之，本實驗證實了硫酸酯化后的SPPM60-D對T淋巴細胞有明顯的激活作用，促進增殖、升高［Ca2＋］i以及促進細胞因子的產生。推測SPPM60-D可能是通過T細胞表面TCR／CD3受體作用，誘導PI3K的激活，PI3K的活化又激活PLC，使PIP2產生IP3與DAG兩個信號分子，IP3作用于胞內內質網鈣庫上的IP3R，引起鈣庫鈣離子的釋放到胞質，少量的Ca2＋通過SOC誘導大量Ca2＋的跨膜內流，從而導致T淋巴細胞［Ca2＋］i的上升，如Fig 6。

Fig 6 Speculated calcium signal pathway induced by SPPM60-D

與未酯化的PPM60-D相比，SPPM60-D具有明顯的促進T淋巴細胞增殖及增強活性的作用。這種變化是由多糖一級結構還是空間結構的變化所引起，T淋巴細胞如何識別、接受硫酸酯化多糖，還需進一步更深入的研究。

參考文獻：

［1］ 王 敏.松花粉的成分及藥理作用研究進展［J］.安徽醫(yī)藥，2008，12（4）：357－9.

［1］ Wang M.The research of component and pharmacological action of pine pollen［J］.Anhui Med Pharm J，2008，12（4）：357－9.

［2］ 耿 越，劉 輝，石麗花，等.馬尾松花粉多糖硫酸酯化前后生物活性的比較研究［J］.中國生化藥物雜志，2010，31（2）：98－102.

［2］ Geng Y，Liu H，Shi L H，et al.Comparative study on bio-activity of polysaccharide from Pinus massoniana pollen and its sulfated derivative［J］.Chin J Biochem Pharm，2010，31（2）：98－102.

［3］ 鄒明暢，崔飛倫，倪鴻昌，等.多糖硫酸酯抗腫瘤作用的研究進展［J］.現代中藥研究與實踐，2008，22（3）：56－9.

［3］ Zou M C，Cui F L，Ni H C，et al.The research of anti-tumor effect of sulfated polysaccharides［J］.Res Pract Chin Med，2008，22（3）：56－9.

［4］ Potter A J，Grossmann A，Rabinovitch P S，et al.The effect of in vitro phorone exposure on glutathione content and T cell antigen receptor（CD3）-stimulated calcium mobilization in murine splenic T lymphocytes［J］．Toxicol In Vitro，1997，11（4）：355－63.

［5］ Zweifach A，Lewis R S.Mitogen-regulated［Ca2＋］current of T lymphocytes is activated by depletion of intracellular［Ca2＋］stores［J］.Proceed Nat Acad Sci，1993，90（13）：6295－9.

［6］ Yip L，Woehrle T，Corriden R，et al.Autocrine regulation of T-cell activation by ATP release and P2X7 receptors［J］．FASEB J，2009，23（6）：1685－93.

［7］ Badou A，Jha M K，Matza D，et al.Critical role for theβregulatory subunits of Cav channels in T lymphocyte function［J］.Proc Natl Acad Sci，2006，103（42）：15529－34.

［8］ 毛 華，楚慧麗，劉月冉，等.馬尾松花粉硫酸酯化多糖調控脾細胞［Ca2＋］i的研究［J］.中國藥理學通報，2012，28（10）：1460－4.

［8］ Mao H，Chu H L，Liu Y R，et al.Influences of sulfated polysaccharide from pine（Pinus massoniana）pollen on the regulation of［Ca2＋］iin splenocytes［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（10）：1460－4.

［9］ 夏 瑜，石麗花，劉 媛，等.馬尾松花粉多糖及其酯化物對離體蟾蜍心肌生理特性的影響［J］.天然產物研究與開發(fā)，2009，21（2）：231－4.

［9］ Xia Y，Shi L H，Liu Y，et al.Effects of pine pollen polysaccharide and its sulfate on the physiological characteristics of isolated toad cardiac muscle［J］.Nat Prod Res Dev，2009，21（2）：231－4.

［10］劉 媛.馬尾松花粉多糖硫酸酯結構解析及對心肌細胞鈣離子通道的調控作用［D］.山東師范大學，2009.

［10］ Liu Y.Structure analysis of a polysaccharide sulfate from pinus massoniana pollen and its modulation on［Ca2＋］channel in myocardial cells［D］.Shandong Normal University，2009.

［11］劉 媛，趙 紅，蔡 云，等.馬尾松花粉多糖硫酸酯化前后對小鼠脾細胞鈣離子濃度的影響［J］.藥物生物技術，2011，18（5）：396－8.

［11］Liu Y，Zhao H，Cai Y，et al.Effects of polysaccharide from masson pine pollen and its sulfated derivative on the cytosolic［Ca2＋］iin mice splenocytes［J］.Pharm Biotechnol，2011，18（5）：396－8.

［12］Song J，Duncan M J，Li G，et al.A novel TLR4-mediated signaling pathway leading to IL-6 responses in human bladder epithelial cells［J］.PLoSPathog，2007，3（4）：e60.

［13］ Caramalho I，Lopes-Carvalho T，Ostler D，et al.Regulatory T cells selectively express toll-like receptors and are activated by lipo-polysaccharide［J］.J Exp Med，2003，197（4）：403－11.

［14］Sakaguchi S，Sakaguchi N，Shimizu J，et al.Immunologic tolerance maintained by CD2＋5CD4＋regulatory T cells：their common role in controlling autoimmunity，tumor immunity，and transplantation tolerance［J］.Immunol Rev，2002，182（1）：18－32.

［15］Miao B，Li J，Fu X，et al.T-cell receptor（TCR）／CD3 is involved in sulfated poly-mannuroguluronate（SPMG）-induced T lymphocyte activation［J］.Int Immunopharmacol，2005，5（7）：1171－82.

［16］Lewis R S.Calcium signaling mechanisms in T lymphocytes［J］．Annu Rev Immunol，2001，19（1）：497－521.

［17］金伯泉，趙修竹，王成濟.細胞和分子免疫學［M］.科學出版社，2001：131－203.

［17］Jin B Q，Zhao X Z，Wang CJ.Cellular and Molecular Immunology［M］.Science Press，2001：131－203.