王 秀，張競競，張 配，孫小錦，劉 哲，張鑫宇，劉 浩

雷公藤甲素（triptolide，TPL）又稱雷公藤內(nèi)酯、雷公藤內(nèi)酯醇，是從衛(wèi)矛科雷公藤屬植物中分離的一種環(huán)氧二帖類內(nèi)酯化合物，是治療類風濕病雷公藤片和雷公藤多苷片等制劑的主要有效成分［1］。現(xiàn)代研究表明，雷公藤甲素不僅具有高效的抗炎、抗類風濕作用，還具有較強的抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)，其對某些腫瘤細胞的殺傷毒性甚至高于紫杉醇和阿霉素［2－3］。但在鼻咽癌中的研究較少，本文擬將雷公藤甲素作用于鼻咽癌CNE-2Z細胞株，觀察其抗鼻咽癌的作用，并探討作用的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 雷公藤甲素（天津美倫醫(yī)藥集團）；CNE-2Z細胞株，蚌埠醫(yī)學院藥學系生化藥理實驗中心提供；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；兔抗人GRP78、Akt、pAkt抗體、鼠抗人 β-actin抗體購自Santa Cruz公司；山羊抗鼠 IgG、山羊抗兔 IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ROS熒光探針-DHE（威格拉斯生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥液配制 雷公藤甲素用二甲基亞砜（DMSO）配成 5.5 mmol·L－1貯液，－20℃保存。臨用前以 RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成 62.5、125、250、500、1 000、2 000及 4 000 nmol·L－1。

1.2.2 細胞培養(yǎng) CNE-2Z細胞接種于含10%新生小牛血清、青霉素（1×105U·L－1）、鏈霉素（100 mg·L－1）和 NaHCO3（33.7 mg·L－1）的 RPMI 1640培養(yǎng)液中，體積分數(shù)0.05 CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.2.3 MTT測定細胞的增殖活性 細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，5×103個每孔。培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，加新鮮含10%血清培養(yǎng)液180μl，對照組加入含0.01%DMSO的培養(yǎng)液20μl；藥物處理組加入不同濃度的雷公藤甲素溶液各20μl，使終濃度分別為 6.25、12.5、25、50、100、200及 400 nmol·L－1，其中DMSO含量不超過0.01%；同時設立調(diào)零組（無細胞組），加入200μl培養(yǎng)液。培養(yǎng)12、24、48 h后加入20μl MTT（以 PBS配成5 g·L－1），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150μl DMSO，37℃孵育30 min，酶標儀上振蕩10 min，檢測波長570 nm處吸光度（A）值，計算細胞存活率：細胞存活率／%＝（實驗組A值－調(diào)零組A值）／（對照組A值－調(diào)零組A值）×100%。以上實驗重復3次。

1.2.4 PI單染法測定雷公藤甲素對CNE-2Z細胞凋亡的影響 細胞接種于6孔培養(yǎng)板，5×106個每孔，培養(yǎng)24 h后，加藥處理，使雷公藤甲素的終濃度為 25、50、100 nmol·L－1，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，顯微鏡下觀察各處理組細胞的變化并拍照，收集細胞，2 500 r·min－1，離心5 min，洗滌2次；預冷的體積分數(shù)為0.75乙醇固定，4℃過夜。測試前用PBS溶液洗滌2遍，加 PI緩沖液（5 mg PI、0.1 g NaC6H5、100μl Triton-100、100μl ddH2O）300μl每管，避光染色30 min，流式細胞儀檢測。

1.2.5 Western blot測定雷公藤甲素對CNE-2Z細胞內(nèi)GRP-78、Akt的表達及Akt磷酸化的影響 將指數(shù)生長的CNE-2Z細胞胰酶消化、懸浮、計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞濃度為3×108個·L－1，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 ml，貼壁培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，加藥處理24 h后冰上提取細胞全蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜；封閉2 h，加一抗，4℃ 孵育過夜；洗膜后加二抗，室溫孵育2 h；Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate試劑盒用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.2.6 雷公藤甲素對CNE-2Z細胞內(nèi)活性氧水平的影響 ROS熒光探針－二氫乙啶（dihydroethidium，DHE），可自由透過活細胞膜進入細胞內(nèi)，并被細胞內(nèi)的ROS氧化，形成氧化乙啶。氧化乙啶可參入染色體DNA中，產(chǎn)生紅色熒光。根據(jù)活細胞中紅色熒光的產(chǎn)生，可以判斷細胞ROS含量的多少和變化。將貼壁生長的CNE-2Z細胞用胰酶消化、懸浮，以5×106個每孔接種于6孔培養(yǎng)板，貼壁生長24 h，棄培養(yǎng)液，給藥處理4 h，加入二氫乙啶使其終濃度為5μmol·L－1，37℃避光孵育 1 h，棄培養(yǎng)液，冰冷 PBS洗 3遍，胰酶消化，離心（800 r·min－1，5 min），收集細胞，用1 ml冰冷PBS重懸細胞，流式細胞儀測定，采用480～535 nm波長激發(fā)，590 nm～610 nm以上的發(fā)射，細胞可分成兩個亞群：ROS陰性細胞僅有很低的熒光強度，ROS陽性細胞有較強的紅色熒光。

2 結(jié)果

2．1 雷公藤甲素對鼻咽癌細胞CNE-2Z的抑制作用 MTT結(jié)果顯示，雷公藤甲素對鼻咽癌細胞CNE-2Z具有較強的抑制作用，并且這種抑制作用隨著濃度的增加及作用時間的延長而增強，見Fig 1。25、50和100 nmol·L－1雷公藤甲素處理 CNE-2Z細胞48 h后，鏡下清晰可見隨著濃度的增加漂浮細胞增加，細胞密度降低，見Fig 2。

Fig 1 Triptolide inhibits proliferation of CNE-2Z cells

Fig 2 The morphological change of CNE-2Z cells after triptolide treatment

2．2 雷公藤甲素對鼻咽癌細胞CNE-2Z凋亡的影響 由 Fig 3可見，25、50和 100 nmol·L－1的雷公藤甲素作用CNE-2Z細胞24 h，均可引起CNE-2Z細胞的凋亡，其中100 nmol·L－1組的凋亡率達到了34.4%，占到整個抑制率46.2%的74%。

2．3 雷公藤甲素對CNE-2Z細胞內(nèi)GRP78、Akt、p Akt的影響 實驗結(jié)果表明，雷公藤甲素作用CNE-2Z細胞24 h后，對細胞內(nèi)GRP-78蛋白的表達無明顯影響，但可明顯減少Akt的表達及其磷酸化水平，見Fig 4。

2．4 雷公藤甲素對CNE-2Z細胞內(nèi)ROS水平的影響 活性氧實驗表明，不同濃度的雷公藤甲素均能誘導鼻咽癌細胞CNE-2Z產(chǎn)生氧化應激。由Fig 5可見，隨著雷公藤甲素濃度的升高，CNE-2Z細胞內(nèi)ROS水平增加。

Fig 3 Triptolide induces apoptosis of CNE-2Z cells

Fig 4 Effect of triptolide on expression of GRP-78，Akt and pAkt

Fig 5 Reactive oxygen species level elevated in CNE-2Z cells

3 討論

雷公藤甲素具有廣譜、高效的抗腫瘤作用，對急性白血病、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌等都有較高活性［4－5］。研究表明，其高效的抗腫瘤作用主要通過誘導腫瘤細胞凋亡實現(xiàn)［6－7］，但其誘導腫瘤細胞凋亡的機制目前尚不清楚。實驗發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素對鼻咽癌也具有較強的抑制作用，同樣通過誘導鼻咽癌細胞凋亡實現(xiàn)。其誘導細胞凋亡的作用可能與其誘導氧化應激，升高活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，及抑制 Akt有關。

ROS由超氧離子、過氧化氫和羥自由基組成，是細胞代謝的副產(chǎn)品。ROS水平對細胞生死有著重要的影響。生理情況下的ROS量小，作為信號傳導分子參與調(diào)解細胞的生理活動［8］。輕度氧化應激，ROS水平輕度升高，可促進細胞存活、增殖、分化等適應性變化；重度氧化應激可使ROS劇烈增加，則造成細胞增殖阻滯、衰老、凋亡和壞死等損傷性變化［9］。腫瘤組織由于高代謝、低氧、缺血等，會持續(xù)誘發(fā)氧化應激，使腫瘤組織內(nèi)ROS升高，促進腫瘤細胞的存活、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等。但若腫瘤細胞內(nèi)ROS水平進一步升高，則抑制腫瘤細胞的增殖，促進細胞的凋亡。腫瘤治療藥物誘導細胞凋亡部分與生成內(nèi)源性氧化劑有關［10］。易靜等［11］研究表明，腫瘤細胞內(nèi)的ROS水平，決定了細胞對凋亡的敏感性。實驗中細胞內(nèi)ROS水平及細胞凋亡率隨著雷公藤甲素濃度的增加而升高，說明細胞的凋亡與雷公藤甲素誘導氧化應激，產(chǎn)生較高水平的ROS有關。

Akt是原癌基因c-Akt的表達產(chǎn)物，又稱蛋白激酶B，在細胞凋亡、細胞增殖、細胞分化、生理代謝、衰老及疾病和癌癥等細胞生理病理活動的調(diào)控中起著至關重要的作用。當細胞面臨氧化損傷時，PI3K／Akt通路的活化對細胞存活非常重要。研究［12］發(fā)現(xiàn)，激活Akt能保護細胞免受H2O2的損傷。反之，若Akt的活化受到抑制，細胞就失去了保護，在氧化應激的刺激下，細胞發(fā)生損傷，進而凋亡。實驗表明，雷公藤甲素可抑制Akt的表達及磷酸化，這一作用可能是雷公藤甲素誘導鼻咽癌細胞CNE-2Z凋亡的主要原因。

總之，雷公藤甲素能夠通過誘導細胞凋亡，抑制鼻咽癌細胞CNE-2Z的生長，作用的機制可能與其誘導氧化應激及抑制Akt的表達及活化有關，具體機制有待于進一步的研究。

參考文獻：

［1］ 李學林，王 璟，唐進法，等.雷公藤多苷片聯(lián)合用藥減毒作用的研究進展［J］.中國現(xiàn)代藥物應用，2013，7（9）：189－90.

［1］ Li X L，Wang J，Tang JF，et al.The development of reducing tox-icity on tripterygium glycosides tablet combination［J］.Chin J Mod Med Applicat，2013，7（9）：189－90.

［2］ Yang S.Triptolide inhibits the growth and metastasis of solid tumors［J］.Mol Cancer Ther，2003，2（1）：65－72.

［3］ Li H.Modulation of P-glycoprotein expression by triptolide in adriamycin-resistant K562／A02 cells［J］.Oncol Lett，2012，3（2）：485－9.

［4］ 王 麗，宋 勇.雷公藤內(nèi)酯醇與非小細胞肺癌研究進展［J］.中國肺癌雜志，2013，16（7）：378－81.

［4］ Wang L，Song Y.Advances on effects of triptolide with non-small cell lung cancer［J］.Zhongguo Fei Ai Za Zhi，2013，16（7）：378－81.

［5］ Lin Y.Herbal compound triptolide synergistically enhanced antitumor activity of amino-terminal fragment of urokinase［J］.Mol Cancer，2013，12（54）：1－16.

［6］ Zhao F.Triptolide induces growth inhibition and apoptosis of human laryngocarcinoma cells by enhancing p53 activities and suppressing E6-mediated p53 degradation［J］.PLoS One，2013，8（11）：80784.

［7］ Rousalova I.Minnelide：a novel therapeutic that promotes apoptosis in non-small cell lung carcinoma in vivo［J］.PLoSOne，2013，8（10）：77411.

［8］ 周映彤，肖洪彬，畢明剛.活性氧與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激［J］.中國藥理學通報，2011，27（5）：597－600.

［8］ Zhou Y T，Xiao H B，Bi M G.ROS and endoplasmic reticulum stress［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（5）：597－600.

［9］ Fruehauf JP，Meyskens F L Jr.Reactive oxygen species：a breath of life or death？［J］.Clin Cancer Res，2007，13（3）：789－94.

［10］Maiti A K.Genetic determinants of oxidative stress-mediated sensitization of drug-resistant cancer cells［J］.Int J Cancer，2012，130（1）：1－9.

［11］易 靜，楊 潔.活性氧調(diào)控蛋白質(zhì)修飾影響腫瘤細胞行為機制的研究進展［J］.上海交通大學學報（醫(yī)學版），2012，32（9）：1122－7.

［11］Yi J，Yang J.Study on the mechanisms underlying that reactive oxygen species regulate posttranslational modification of the proteins and affect the behaviors of cancer cells［J］.J Shanghai Jiaotong Univ（Med Sci），2012，32（9）：1122－7.

［12］張 梅，李 衛(wèi)，郭瑞鮮，等.PI3K／AKT通路介導H2O2預處理減輕PC12細胞氧化損傷［J］.基礎醫(yī)學與臨床，2011，31（8）：894－9.

［12］Zhang M，Li W，Guo R X，et al.PI3K／AKT pathway mediates the anti-oxidative injury induced by H2O2preconditioning in PC12 cell［J］.Basic Clin Med，2011，31（8）：894－9.