李吉鋒，王淑榮

(渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院藥物分析工程中心，渭南 714099)

柴胡疏肝散分煎混合液和合煎液指紋圖譜及有效成分變化分析*

李吉鋒，王淑榮

(渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院藥物分析工程中心，渭南 714099)

目的 分析復(fù)方柴胡疏肝散分煎液和合煎液中芍藥苷和橙皮苷的溶出量和色譜指紋圖譜相似度,確認(rèn)是否適合采用臨床顆粒復(fù)配方法使用。方法采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定,用中藥色譜指紋圖譜相似度軟件對(duì)譜圖相似度進(jìn)行分析。結(jié)果合煎有利于有效成分芍藥苷和橙皮苷的溶出,合煎過程發(fā)生化學(xué)反應(yīng),有少量新的組分生成或者部分組分消失。結(jié)論復(fù)方柴胡疏肝散不適合采用顆粒配方服用。

柴胡疏肝散分煎液；柴胡疏肝散合煎液；溶出量；指紋圖譜

柴胡疏肝散出自《景岳全書》第五十六卷,由陳皮(醋炒)、柴胡各6 g,川芎、枳殼(麩炒)、白芍、香附各4.5 g,甘草(炙)1.5 g組成,可疏肝解郁,主治肝氣郁滯證。傳統(tǒng)中藥煎劑使用方法歷經(jīng)數(shù)千年,各種有效、有害成分的協(xié)同或拮抗效應(yīng)已經(jīng)過實(shí)際檢驗(yàn),能夠充分發(fā)揮其藥效,減少毒性。目前一些醫(yī)院為方便患者使用,讓患者將單味顆粒組成復(fù)方以后沖服。由于各單味中藥是提前分煎得到,組成復(fù)方過程的協(xié)同或者拮抗作用的可能性降低,有可能對(duì)于某一方劑的藥效產(chǎn)生影響。對(duì)于中藥復(fù)方前后單味中藥藥性的變化,科研工作者近年來逐漸從化學(xué)角度開始探討。很多分析工作者對(duì)于使用比較多的復(fù)方進(jìn)行了分析[1-9]。筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用高效液相色譜法對(duì)于柴胡疏肝散分煎液和合煎液中的有效成分芍藥苷和橙皮苷的溶出量進(jìn)行分析比較,討論兩種不同煎煮方法對(duì)有效成分溶出的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ShimadzuLC-10ATVP泵,SCL-10AVP控制器,DGU-14A脫氣機(jī),CTO-10AVP柱溫箱,SPD-10AVP紫外檢測(cè)器,ShimadzuC-18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm),ShimadzuClass-VP6.12工作站,SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮),超聲脫氣機(jī)(KQ-250DE數(shù)控超聲,昆山超聲儀器廠)。

1.2 試藥 甲醇(色譜純,天津科密歐),乙腈(色譜純,天津科密歐),磷酸(AR,開封化學(xué)試劑廠),二次純化水,芍藥苷對(duì)照品(寶雞晨光生物科技有限公司,批號(hào):20121005,純度:98%),橙皮苷對(duì)照品(寶雞晨光生物科技有限公司,批號(hào):20120927,純度:98%);柴胡(陜西)、白芍(浙江)、陳皮(江西)、枳殼(江西)、香附(山東)、川芎(四川)、甘草(寧夏)均購(gòu)自陜西省渭南市老百姓大藥房,所有飲片均經(jīng)駐店藥師確認(rèn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 0.2%磷酸-乙腈梯度洗脫,洗脫程序見表1,流速1.0 mL·min-1,柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版(國(guó)家藥典委員會(huì))。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 配制對(duì)照品溶液,稱取芍藥苷和橙皮苷對(duì)照品精密稱定,加甲醇超聲溶解后定容于50 mL量瓶,分別配成50.00 mg·L-1對(duì)照品溶液。兩種對(duì)照品溶液各進(jìn)樣10 μL的譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

圖1 芍藥苷和橙皮苷對(duì)照品HPLC色譜圖S1.芍藥苷;S2.橙皮苷

2.3 樣品溶液的制備

2.3.1 合煎液的制備 按照復(fù)方用量準(zhǔn)確稱取各味中藥于500 mL燒杯,加入8.5倍質(zhì)量二次純化水,蓋上表面皿,浸泡10 min,于電爐上大火燒開,小火煎煮20 min,冷卻后傾出上清液。再加入4.5[9]倍質(zhì)量的二次純化水,大火燒開后小火煎煮15 min,傾出上清液,并與第一次的清液合并,定容到100 mL量瓶。準(zhǔn)確量取25.00 mL,水浴低溫蒸干得到顆粒,加入甲醇超聲處理后定容于25 mL量瓶,進(jìn)樣前用孔徑0.45 μm濾膜過濾[9]。進(jìn)樣10 μL,合煎液色譜圖見圖2。

2.3.2 分煎混合液的制備 按照復(fù)方用量分別準(zhǔn)確稱取各味中藥于7個(gè)100 mL燒杯,分別加入8.5倍質(zhì)量二次純化水,蓋上表面皿,浸泡10 min,于電爐上大火煮沸,小火煎煮20 min,冷卻后分別傾出上清液,混合于同一燒杯中。分別在7種中藥中各加入4.5倍質(zhì)量二次純化水,大火煮沸后小火煎煮15 min,冷卻后分別傾出上清液,混合后與第一次的合并,定容到100 mL量瓶。準(zhǔn)確量取25.00 mL,水浴低溫蒸干得到顆粒,加入甲醇超聲處理后定容于25 mL量瓶。進(jìn)樣前用孔徑0.45 μm濾膜過濾。進(jìn)樣10 μL,分煎液譜圖見圖2。對(duì)合煎液和分煎液指紋圖譜采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版進(jìn)行相似度分析比較。

2.4 色譜測(cè)定方法考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 將2種對(duì)照品溶液各連續(xù)進(jìn)樣5次,測(cè)定色譜峰面積。芍藥苷和橙皮苷面積的RSD分別為1.6%和1.3%,表明方法精密度較好。

圖2 柴胡疏肝散合煎液和分煎液HPLC圖S1.分煎液;S2.合煎液

2.4.2 線性范圍考察 分別取各對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣5,10,15,20,25 μL,分別測(cè)定峰面積。以測(cè)得的各對(duì)照品溶液的峰面積為縱坐標(biāo),以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程和相關(guān)性系數(shù)。各對(duì)照品在0.25～1.25 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。芍藥苷回歸方程Y= 58 704X+519 939,r=0.993 2;橙皮苷回歸方程Y=174 674X+457 984,r=0.997 3。

2.4.3 回收率實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確量取混合后合煎液25.00 mL,加入一定量芍藥苷和橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,水浴低溫蒸干,加入甲醇超聲處理后定容于25 mL量瓶。進(jìn)樣前用孔徑0.45 μm濾膜過濾,測(cè)定后計(jì)算各個(gè)對(duì)照品的回收率。

據(jù)“2.3.3”加標(biāo)實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果計(jì)算,加標(biāo)回收率分別為芍藥苷92.5%和橙皮苷95.4%(5次平均,RSD分別為1.2%和1.4%),方法準(zhǔn)確性較好。見表2。

表2 芍藥苷和橙皮苷回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 mg

2.4.4 穩(wěn)定性考察 取分煎液,分別在0,2,4,8,12 h進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,結(jié)果芍藥苷和橙皮苷的RSD分別為0.9%,1.3%。

2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按照“2.3.1”項(xiàng)制備合煎液溶液5份,分別測(cè)定芍藥苷和橙皮苷的含量,RSD分別為1.2%和1.2%。

2.5 測(cè)定結(jié)果 將“2.3.1”和“2.3.2”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)所得溶液分別用HPLC在“1.1”項(xiàng)儀器工作條件下測(cè)定。結(jié)果復(fù)方后合煎液芍藥苷含量1.456 mg,橙皮苷含量0.578 mg,分煎后混合液芍藥苷與橙皮苷含量分別為1.332和0.324 mg。

3 討論

中藥組成復(fù)方后可能存在協(xié)同或者拮抗效應(yīng),使得煎煮過程中各種有效成分的溶出率發(fā)生變化,也可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng),使得某一組分的溶出量發(fā)生變化,從而對(duì)其功效產(chǎn)生影響。中成藥加工過程充分考慮以上因素,采取方劑合煎后,將得到的粉末制成丸劑或者片劑服用,使得其組成和煎劑相同,功效相同。而目前一些醫(yī)院采用將分煎后得到的顆粒按照復(fù)方混合沖服的方法沒有充分考慮以上問題。針對(duì)可能存在的問題,筆者選擇傳統(tǒng)的柴胡疏肝散方劑,針對(duì)其中芍藥苷和橙皮苷的溶出量進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)于柴胡疏肝散而言,合煎液中芍藥苷溶出量(1.456 mg)稍高于分煎液(1.332 mg),合煎液橙皮苷溶出量明顯高于分煎液,接近或達(dá)到分煎液溶出量的兩倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,對(duì)于柴胡疏肝散而言,合煎可能由于協(xié)同效應(yīng)等,更有利于其有效成分芍藥苷和橙皮苷的溶出,使得藥效更明顯。采用中藥色譜指紋圖譜相似度軟件分析后發(fā)現(xiàn),分煎液和合煎液的譜圖相似度為0.953,這表明在合煎過程中發(fā)生了化學(xué)反應(yīng),有少量新的組分生成或者部分組分消失,如在約15 min和48 min合煎液相對(duì)分煎液分別減少一個(gè)吸收峰,具體組分確認(rèn)及變化分析需要結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析。除芍藥苷和橙皮苷外,從圖2還可以發(fā)現(xiàn),兩個(gè)譜圖中的其他一些峰高度也存在差異,說明合煎使得不同組分的溶出率發(fā)生了變化。綜上所述,建議柴胡疏肝散臨床使用不采用顆粒物配伍使用的方法,而盡可能采用生藥合煎服用的方法。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.035

R286;R927.1

A

1004-0781(2014)03-0392-03

2013-05-01

2013-06-22

*陜西省軍民融合研究基金(12JMR12)

李吉鋒(1977-),男,山東青島人,副教授,碩士,主要從事藥物分析工作。電話:0913-2136931,E-mail：ustc1@163.com。