雷偉，余楚欽，林華慶，周小圓

(廣東藥學(xué)院，廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006)

·藥物制劑與藥品質(zhì)量控制·

Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化他克莫司傳遞體制備工藝*

雷偉，余楚欽，林華慶，周小圓

(廣東藥學(xué)院，廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006)

目的 確定他克莫司傳遞體的最優(yōu)處方工藝。方法以包封率、粒徑作為響應(yīng)值,采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化處方,并評(píng)價(jià)其理化性質(zhì)。結(jié)果最優(yōu)處方工藝是藥脂比為0.06,聚山梨酯80∶蛋黃卵磷脂為0.31,超聲時(shí)間9.5 min,制備的傳遞體包封率為85.930%,粒徑為101.8 nm,具備一定的體外形變能力和穩(wěn)定性。結(jié)論Box-Behnken響應(yīng)面法能準(zhǔn)確地優(yōu)化他克莫司傳遞體的處方工藝。

他克莫司；傳遞體；Box-Behnken響應(yīng)面法；制備工藝

他克莫司(tacrolimus,FK506)軟膏(商品名:普特彼?)于2002年被批準(zhǔn)用于治療中到重度特應(yīng)性皮炎[1]。但由于FK506的強(qiáng)親脂性(油水分配系數(shù)logP=3.96±0.83)、大分子量(相對(duì)分子質(zhì)量822.05)及其環(huán)狀分子結(jié)構(gòu),軟膏中的藥物主要潴留在皮膚角質(zhì)層中,無(wú)法到達(dá)深層皮膚組織發(fā)揮藥效[2]。傳遞體(transfersomes)由德國(guó)學(xué)者GREGOR等[3]首次提出,它是將表面活性劑(如聚山梨酯80、膽酸鈉等)加入普通脂質(zhì)體材料中制成具有很強(qiáng)的自身形變能力,可穿透比它本身小數(shù)倍的皮膚孔道的類脂質(zhì)體。筆者在本實(shí)驗(yàn)中將FK506包裹于傳遞體中,采用Box-Behnken響應(yīng)面法以較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)和較短的時(shí)間[4]對(duì)他克莫司傳遞體的處方工藝參數(shù)進(jìn)行全面有效的優(yōu)化,同時(shí)考察其體外變形能力及穩(wěn)定性,為以后他克莫司傳遞體經(jīng)皮滲透研究打下基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國(guó)Dinonex公司),超聲波細(xì)胞粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司),JEM-1400透射電鏡(日本JEOL電子公司),DelsaTMNano C粒徑儀(美國(guó)Beckman Coulter有限公司),LSP01-1A單推注射泵(蘭格注射泵有限公司)。

1.2 試藥 他克莫司對(duì)照品(上海同田生物技術(shù)股份有限公司,純度:99.4%,批號(hào):12033031),他克莫司原料藥(華東醫(yī)藥有限公司,純度:98.0%,批號(hào):091001),蛋黃卵磷脂(Lipoid E80,PC,上海東尚生物科技有限公司提供,批號(hào):F20100021),其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 他克莫司傳遞體的制備 采用薄膜蒸發(fā)-探頭式超聲分散法制備。稱取處方量蛋黃卵磷脂、聚山梨酯80(分析純)、他克莫司置于圓底燒瓶,無(wú)水乙醇溶解完全,35℃水浴旋轉(zhuǎn)揮干乙醇使成均一類脂薄膜。然后往圓底燒瓶中加入pH6.5 PBS水合介質(zhì)20 mL,旋轉(zhuǎn)洗膜1 h,冰水浴下探頭式超聲處理(超聲2 s,停2s),孔徑0.20 μm微孔濾膜過(guò)濾,即得到帶淡藍(lán)色乳光的傳遞體混懸液。

2.2 傳遞體的含量和包封率測(cè)定

2.2.1 含量測(cè)定方法 色譜柱:Agilent公司ZORBAX SB-C8(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:0.1%磷酸∶乙腈(40∶60);柱溫:60℃;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;流速:1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量:20 μL。

取他克莫司對(duì)照品20 mg精密稱定,置20 mL量瓶,配成貯備液,吸取貯備液1 mL,用流動(dòng)相稀釋至10 mL,得100 μg·mL-1對(duì)照品溶液,調(diào)節(jié)進(jìn)樣體積分別為1,2,5,10,40,80 μL,以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C)作線性回歸,得回歸方程為A=0.285 1C-0.516 7,r=0.999 8,在5～400 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。精密吸取空白傳遞體1.0 mL置于10 mL量瓶,依次加入貯備液0.8,1.0,1.2 mL,甲醇破乳,每個(gè)濃度平行配置3份,測(cè)得80,100, 120 μg·mL-1回收率,結(jié)果均在95%～105%范圍內(nèi), RSD均＜2%。取他克莫司傳遞體混懸液1 mL置于10 mL量瓶,甲醇破乳,得供試品溶液,供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定,日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)RSD值＜2%(n=6), HPLC測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化處方工藝

2.3.1 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化他克莫司傳遞體制備的處方工藝。采用Design-Expert?設(shè)計(jì)軟件,以包封率(Y1,%)、粒徑(Y2,nm)為優(yōu)化指標(biāo),根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及最高或最低條件下制備傳遞體的可行性,選取藥脂比(藥物∶PC,X1,質(zhì)量比)、聚山梨酯80∶PC(X2,質(zhì)量比)、超聲時(shí)間(X3,min)作為考察對(duì)象,3個(gè)設(shè)計(jì)水平代碼分別為0,+1,-1,設(shè)計(jì)3因素、3水平、17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),響應(yīng)面因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表Tab.1 Factors and levels of response surface method

2.3.2 回歸模型擬合及預(yù)測(cè) 對(duì)包封率(Y1)、粒徑(Y2)進(jìn)行回歸分析,建立多元二次回歸模型:Y=b0+ b1X1+b2X2+b3X3+b12X1X2+b13X1X3+b23X2X3+其中,Y為響應(yīng)值;b0為常數(shù)項(xiàng), b1、b2、b3為線性系數(shù),b12、b13、b23為相互項(xiàng)系數(shù),b11、b22、b33為平方項(xiàng)系數(shù)。

根據(jù)回歸模型,繪制三維效應(yīng)面圖,從每一個(gè)效應(yīng)面均可以得到一個(gè)較優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件范圍,幾個(gè)較優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)一步重疊,即可獲得最優(yōu)條件。

2.3.3 結(jié)果驗(yàn)證 根據(jù)優(yōu)化設(shè)計(jì)獲得的最優(yōu)條件制備3批樣品,將指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較,計(jì)算偏差。17次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及響應(yīng)值見(jiàn)表2。

2.4 形態(tài)觀察 將優(yōu)化得到的傳遞體混懸液用PBS稀釋10倍,滴到銅網(wǎng)上,放置約1 min以便使傳遞體吸附,用濾紙吸去多余液體,用2%磷鎢酸溶液負(fù)染1 min,濾紙吸去多余染色液,干燥后用透射電子顯微鏡觀察傳遞體形態(tài)。

2.5 粒徑分布測(cè)定 粒徑測(cè)定使用Beckerman粒徑儀。傳遞體混懸液用PBS稀釋1倍,測(cè)定溫度為25℃。

3 結(jié)果

3.1 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果及模型擬合 Box-Behnken響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2,用Design-Expert 8.0.4版軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,以包封率和粒徑兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)分別對(duì)3個(gè)因素進(jìn)行多元二項(xiàng)式方程擬合,二項(xiàng)式方程分別為:

表2 Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Tab.2 Designs and results of Box-Behnken response surface method

3.2 效應(yīng)面優(yōu)化及預(yù)測(cè) 根據(jù)擬合方程繪制描述各因素與指標(biāo)之間關(guān)系的效應(yīng)曲面,結(jié)果見(jiàn)圖1。從效應(yīng)面的最高點(diǎn)可以看出所選范圍存在極值,可以直觀地判斷各因素的最優(yōu)范圍。他克莫司為親脂性藥物,主要分布于脂質(zhì)體膜的雙分子層結(jié)構(gòu)中,固定超聲8 min,隨著藥脂比逐漸增大,包封率相應(yīng)增大,藥物在傳遞體中的分布逐漸達(dá)到飽和狀態(tài),繼續(xù)增加藥物,超出磷脂的承載能力,使傳遞體的雙層結(jié)構(gòu)破壞,傳遞體容易發(fā)成融合,包封率降低,粒徑增大,優(yōu)化的藥脂比范圍為0.03～0.08。聚山梨酯80作為表面活性劑,主要嵌插于傳遞體膜中,增強(qiáng)膜的流動(dòng)性,使得膜彈性形變?cè)龃?。一定濃度的聚山梨?0可增加他克莫司在傳遞體混懸液中的溶解度,且使傳遞體具有較大的形變能力,易于破裂成小粒子,但隨著表面活性劑濃度進(jìn)一步增加,易形成混合膠團(tuán),降低對(duì)藥物的包載能力,同時(shí)整個(gè)體系的粒徑變大[8],聚山梨酯80∶PC值在0.25～0.40范圍較適宜。粒徑受超聲時(shí)間長(zhǎng)短影響最明顯,超聲時(shí)間越長(zhǎng),粒徑越小,但同時(shí)也會(huì)引起傳遞體中藥物的泄漏,導(dǎo)致包封率的降低,超聲時(shí)間控制在8～11 min內(nèi),可得到適宜的粒徑范圍90～130 nm。

表3 二項(xiàng)式方程模型的顯著性分析Tab.3 Significance analysis of binomial equation model

圖1 各自變量與包封率、粒徑的效應(yīng)面圖Fig.1 Response surfaces of entrapment efficiency and particle diameter with independent variables

使用Design-Expert 8.0.4版軟件根據(jù)響應(yīng)面曲線預(yù)測(cè)出他克莫司傳遞體的最優(yōu)處方:X1=0.06、X2= 0.31、X3=9.5,即PC 0.800 g、他克莫司48 mg、聚山梨酯80 0.248 g、PBS 20 mL,超聲處理9.5 min。按此處方分別制備3批傳遞體,其實(shí)驗(yàn)平均值與預(yù)測(cè)值的比較見(jiàn)表4,平均包封率85.930%,平均粒徑101.8 nm,相對(duì)偏差均＜5%,各實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值吻合良好,證明了用效應(yīng)面法獲得的優(yōu)化區(qū)域比較準(zhǔn)確。其中,偏差(%)=(實(shí)驗(yàn)值-預(yù)測(cè)值)/預(yù)測(cè)值×100%。

表4 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證Tab.4 Verification of response surface methodology n=3

3.3 傳遞體粒徑及電鏡觀察結(jié)果 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到的傳遞體混懸液略帶淡藍(lán)色,粒徑分布范圍窄,呈正態(tài)分布,平均粒徑101.8 nm,多分散性指數(shù)為0.299(圖1)。透射電鏡下呈橢圓形,有指紋狀螺旋,具有明顯的脂膜包裹形態(tài)(圖2)。

圖2 他克莫司傳遞體的粒徑分布圖Fig.2 Size distribution of tacrolimus transfersomes

3.4 變形性 在0.2 MPa外力作用下,普通脂質(zhì)體、傳遞體、水通過(guò)濾膜的時(shí)間分別為306,184和120 s,即P脂質(zhì)體=2.550,P傳遞體=1.533,這說(shuō)明,相比于普通脂質(zhì)體,傳遞體中表面活性劑聚山梨酯80的存在可促進(jìn)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的變形,使之更易通過(guò)濾膜,為后期將傳遞體用作透皮轉(zhuǎn)運(yùn)載體,將大分子藥物送入深層皮膚組織提供了體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖3 他克莫司傳遞體的透射電鏡照片(×30 000)Fig.3 TEM photograph of tacrolimus transfersomes at amplification of 30 000 times

3.5 加速穩(wěn)定性 加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中,A0=0.486,A1=0.455,得Ke=0.0637,離心前后吸光度值變化很小,說(shuō)明傳遞體混懸液具有一定的穩(wěn)定性。

4 討論

常用的包封率測(cè)定方法有葡聚糖凝膠柱層析法[9]、離心法[10]、透析法,這三種方法本實(shí)驗(yàn)中均有嘗試。由于他克莫司難溶于水,用水洗脫時(shí)容易析出結(jié)晶,在凝膠柱中保留時(shí)間短,導(dǎo)致載藥傳遞體與游離藥物很難完全分離,該法不適宜用于他克莫司傳遞體包封率的測(cè)定。同時(shí),采用超速冷凍離心法,4℃離心, (35 000 r·min-1,3 h),游離藥物與載藥傳遞體完全分離,包封率測(cè)定結(jié)果與透析法接近,但由于本實(shí)驗(yàn)室不具備超速冷凍離心機(jī),綜合考慮,最終選用透析法測(cè)定他克莫司傳遞體的包封率。

筆者在前期處方篩選實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),不同的表面活性劑對(duì)傳遞體的影響不一。其中,包封率:聚山梨酯-80＞膽酸鈉＞司盤-80,粒徑:聚山梨酯-80≈膽酸鈉＞司盤-80。用司盤-80作為表面活性劑,傳遞體混懸液分層明顯,超聲分散后粒徑仍然很大。ELMAGHRABY等[11]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),不同表面活性劑的親水親油平衡值(HLB值)不同,在脂質(zhì)相與水相的親和分布能力也不一樣,因而其與類脂質(zhì)膜相互作用能力大小也有差異。司盤-80(HLB=4.3)親脂性最強(qiáng),與藥物競(jìng)爭(zhēng)性插于類脂質(zhì)膜中,擾亂了脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu),容易造成類脂結(jié)構(gòu)的破壞和藥物的泄漏。不同表面活性種類是否會(huì)對(duì)傳遞體透皮性能產(chǎn)生影響,還需進(jìn)一步考察研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.024

Optimized Preparation of Tacrolimus Transfersomes by Box-Behnken Response Surface Method

LEI Wei,YU Chu-qin,LIN Hua-qing,ZHOU Xiao-yuan
(Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou Provincial Key Laboratory of Advanced Drug Delivery,Guangzhou 510006,China)

Objective To determine the optimal process for the preparation of tacrolimus transfersomes.MethodsThe preparation of tacrolimus transfersomes was optimized via the Box-Behnken response surface method with entrapment efficiency and diameters as responding indicators,and their physicochemical properties were evaluated.ResultsThe optimized technical parameters were as follows:drug-lipid as 0.06;polysorbate80-PC as 0.31;ultrasonic for 9.5 min.The encapsulation efficiency and diameters of the optimized tacrolimus transfersomes were 85.930%and 101.8 nm,respectively.Tacrolimus transfersomes had a certain deformation ability and stability.ConclusionBox-Behnken response surface method could accurately optimize the preparation of tacrolimus transfersomes.

Tacrolimus;Transfersomes;Box-Behnken response surface method;Optimized preparation

R979.5;TQ460.1

A

1004-0781(2014)03-0355-06

2013-02-19

2013-03-20

*藥物制劑關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化示范(2008A1-E4101)

雷偉(1989-),女,湖北荊州人,在讀碩士,主要研究方向:藥物新劑型與新技術(shù)。電話:020-39352518,E-mail：leiwei-1234@163.com。

林華慶,男,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事藥物新劑型與新技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)。電話:020-39352518,E-mail：huaqing_@163.com。