馬杰，楊偉，關(guān)碩，胡俊霞，高文斌，曾常茜，梁文波

(1.遵義醫(yī)學(xué)院，遵義 563000;2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，大連 116622;3.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤科，大連116000)

西黃丸乙酸乙酯提取物抗腫瘤活性研究*

馬杰1，楊偉2，關(guān)碩2，胡俊霞2，高文斌3，曾常茜2，梁文波2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院，遵義 563000;2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，大連 116622;3.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤科，大連116000)

目的 研究西黃丸乙酸乙酯提取物抗腫瘤作用及對(duì)荷瘤大鼠免疫功能的影響,篩查西黃丸的抗腫瘤活性部位。方法用W256乳腺癌細(xì)胞建立荷瘤大鼠模型,隨機(jī)分為正常對(duì)照組,模型對(duì)照組,陽(yáng)性藥物(香菇多糖)組,西黃丸高劑量組,西黃丸乙酸乙酯提取物高、中、低劑量組。給藥治療14 d,取瘤稱重,計(jì)算抑瘤率;腹主動(dòng)脈取血,流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群及B7-1的含量;酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)外周血白細(xì)胞介素2(IL-2)、IL-6、IL-10、β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)、γ干擾素(IFN-γ)表達(dá)水平。結(jié)果西黃丸乙酸乙酯高劑量組抑瘤率30.41%;西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量組、B7-1含量及IL-2、IFN-γ水平均高于模型對(duì)照組,IL-6及TGF-β水平均低于模型組;IL-10與陰性對(duì)照組比較,均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論西黃丸乙酸乙酯提取物通過(guò)上調(diào)IL-2、IFN-γ水平及提高細(xì)胞含量,降低腫瘤相關(guān)炎性因子IL-6、TGF-β水平,提高了機(jī)體免疫清除功能,發(fā)揮抗腫瘤作用,提高原藥生物利用度。乙酸乙酯提取物可能是西黃丸的主要活性部位之一。

西黃丸；乙酸乙酯提取物；乳腺癌；腫瘤；細(xì)胞因子

西黃丸又稱犀黃丸,出自清代王洪緒所著《外科證治全生集·卷四》,由牛黃、麝香、乳香(醋制)、沒藥(醋制)4味名貴中藥組成,是抗腫瘤中成藥的經(jīng)典名方,其主要功效為清熱解毒、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)等[1]。目前廣泛用于乳腺癌、肝癌、白血病等惡性腫瘤的治療及輔助治療,臨床證實(shí)其可提高腫瘤患者的生存率,改善中晚期腫瘤患者的生活質(zhì)量[2]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí),西黃丸組方藥材富含抗癌成分,且主要為脂溶性成分,如?；撬?、膽紅素、麝香酮、β-欖香烯等[3]。筆者通過(guò)對(duì)西黃丸進(jìn)行水蒸汽、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙醇梯度提取,證實(shí)三氯甲烷、乙醇提取的組分均具有良好的抗腫瘤作用[4]。筆者在本實(shí)驗(yàn)中觀察西黃丸乙酸乙酯提取物對(duì)荷瘤大鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 清潔級(jí)Wistar大鼠,雌性,體質(zhì)量(180±20)g(70只)及(70±10)g(10只),購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(遼)20080002。大鼠乳腺癌細(xì)胞株Walker256,購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 儀器 流式檢測(cè)儀FACSVantage為BD公司產(chǎn)品;ELX800型酶標(biāo)儀為美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品;PL203型電子精密天平為梅特勒托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品;飛鴿TDL-40B型臺(tái)式離心機(jī)為上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試劑 熒光標(biāo)記抗體Anti-Rat CD3 PE;Anti-Rat CD4 FITC;Anti-Rat CD8a PerCP購(gòu)自于美國(guó)Bioscience公司;Anti-Rat CD80 PE購(gòu)自于美國(guó)BioLegend公司;大鼠ELISA試劑盒白細(xì)胞介素2(interleukin 2,IL-2)、IL-6、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming grouth factor, TGF-β)、干擾素γ(interferon γ,IFN-γ)由上海朗頓生物科技有限公司生產(chǎn);淋巴細(xì)胞分離液為TBD science公司產(chǎn)品;肝素鈉注射液(批號(hào):100103)為上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。西黃丸(每20粒質(zhì)量1 g)由北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠生產(chǎn)(批號(hào):11020073);香菇多糖由浙江普洛康裕天然藥物有限公司生產(chǎn)(基片質(zhì)量0.1 g,批號(hào):120501)。

1.4 西黃丸乙酸乙酯提取物的制備 ①取西黃丸180 g,粉碎,轉(zhuǎn)入500 mL圓底燒瓶,加入3倍體積無(wú)水乙酸乙酯,超聲振蕩30 min,組裝熱回流提取裝置,于電熱套上加熱回流提取2 h,濾紙過(guò)濾,收集濾液;濾渣重復(fù)提取2次。合并3次提取液,于37℃恒溫水浴鍋中揮發(fā)乙酸乙酯,得乙酸乙酯提取物收率為7.9%。②采用人與大鼠劑量換算公式,計(jì)算各組給藥量,西黃丸乙酸乙酯提取物高、中、低分別按108.6,43.5, 21.7 mg·kg-1,西黃丸高劑量按1.37 g·kg-1,陽(yáng)性對(duì)照(香菇多糖)按230 mg·kg-1,以0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液為溶劑,將給藥劑量配制為1 mL·(100 g)-1?？瞻讓?duì)照組及模型對(duì)照組給予等量溶劑。

1.5 動(dòng)物模型的建立 ①調(diào)整Walker256細(xì)胞濃度為2×107個(gè)·mL-1,抽取細(xì)胞1 mL,注入(70±10)g雌性Wistar鼠腹腔,傳代。7～8 d小鼠出現(xiàn)明顯腹水癥狀,收集腹水,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS)洗滌,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107·mL-1。將(180±20)gWistar雌性大鼠,隨機(jī)取10只不做處理為正常對(duì)照;其他按每只0.4 mL腫瘤細(xì)胞接種于大鼠右側(cè)腋下建立荷瘤模型,隨機(jī)分為6組,每組10只[5]。②造模后第2天起,按體質(zhì)量灌胃給藥,每天2次,連續(xù)給藥14 d。

1.6 大鼠抑瘤率的測(cè)定 末次給藥前禁食12 h,以20%烏拉坦腹腔麻醉。鈍性剝離瘤組織,取瘤稱質(zhì)量,計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率(%)=(模型對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-治療后平均瘤質(zhì)量)/模型對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群及B7-1的含量腹主動(dòng)脈取血2 mL,適量肝素抗凝,加入等體積PBS液,混勻;緩慢轉(zhuǎn)入2 mL淋巴細(xì)胞分離液上層,室溫2 000 r·min-1離心20 min;收集淋巴細(xì)胞,避光條件下加入相應(yīng)抗體染色。4℃避光,冰浴20 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)及黏附分子B7-1含量。

1.8 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)IL-2、IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-γ的表達(dá)水平 新鮮血液置于37℃恒溫水浴鍋靜置4 h,3 500 r·min-1室溫離心10 min,吸取上層血清,嚴(yán)格按照大鼠IL-2、IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-γ定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)吸光度(A)值,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲取血清中IL-6、IL-10、TGF-β濃度。

2 結(jié)果

2.1 西黃丸乙酸乙酯提取物對(duì)荷瘤大鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響 接種Walker256后,大鼠精神狀態(tài)較差,進(jìn)食減少,行動(dòng)呆滯,皮毛粗糙無(wú)光澤;4～5 d均有瘤塊實(shí)體直徑約0.5 cm。而陽(yáng)性對(duì)照及西黃丸乙酸乙酯提取物給藥組大鼠食量及運(yùn)動(dòng)狀態(tài)均好于模型對(duì)照組。西黃丸乙酸乙酯提取物具有一定的抑瘤作用,其高劑量組抑瘤率30.41%,與模型對(duì)照組比較,瘤質(zhì)量顯著降低(P＜0.05);與西黃丸高劑量組(33.13%)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)果見表1。

2.2 西黃丸乙酸乙酯提取物對(duì)荷瘤大鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群及B7-1含量的影響 與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組血清含量顯著降低(P＜ 0.05);西黃丸乙酸乙酯提取物中劑量組綜合指標(biāo)優(yōu)于西黃丸高劑量組,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型對(duì)照組比較,西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量組1含量顯著升高(P＜0.01),結(jié)果見表2。

2.3 西黃丸乙酸乙酯提取物對(duì)荷瘤大鼠外周血細(xì)胞因子的影響 與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組血清IL-2、IFN-γ水平顯著降低,IL-6、IL-10、TGF-β水平顯著升高(P＜0.01);與模型對(duì)照組比較,西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量組血清IL-2、IFN-γ水平顯著升高(P＜0.01),IL-6、TGF-β顯著降低(P＜0.05),結(jié)果見表3,4。

表1 7組大鼠腫瘤生長(zhǎng)的情況Tab.1 The tumor growth of seven groups of rats ±s

表1 7組大鼠腫瘤生長(zhǎng)的情況Tab.1 The tumor growth of seven groups of rats ±s

與模型對(duì)照組比較,*1P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.05

組別劑量/(mg·kg-1)大鼠/只瘤質(zhì)量/g抑瘤率/%正常對(duì)照組0.0100.00±0.000.00模型對(duì)照組0.0106.61±0.610.00西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量組108.6104.60±0.42*130.41中劑量組43.5105.13±0.3722.39低劑量組21.7105.71±0.5013.62西黃丸高劑量組1 370104.42±0.57*133.13香菇多糖組230105.00±0.44*124.36

3 討論

西黃丸由牛黃、麝香、乳香、沒藥粉碎,輔以黏米飯制成,其活性組分在治療中主要依賴溶出,生物利用度不高。筆者采用水蒸汽、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙醇進(jìn)行梯度提取,以篩選西黃丸抗腫瘤的活性部位,提高其生物利用度。研究結(jié)果顯示,西黃丸乙酸乙酯提取物具有明確的抑瘤作用,與模型對(duì)照組比較,高劑量組瘤質(zhì)量明顯降低,但其抗腫瘤活性與西黃丸高劑量組類似,提示西黃丸乙酸乙酯提取物是西黃丸抗腫瘤作用主要活性部位之一。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅取決于腫瘤細(xì)胞本身,還取決于腫瘤細(xì)胞生存的環(huán)境[6]。免疫系統(tǒng)具有免疫清除功能,因而消滅和殺傷腫瘤細(xì)胞;但同時(shí)也會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生“篩選”作用,這可能促進(jìn)腫瘤向惡性程度的分化,而腫瘤細(xì)胞也會(huì)對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生重塑作用,改變機(jī)體的免疫環(huán)境。隨著對(duì)腫瘤免疫機(jī)制的深入研究,免疫編輯理論的提出深刻地闡釋了機(jī)體免疫系統(tǒng)與腫瘤的相互作用,即免疫清除、免疫平衡、免疫逃逸[7]。在免疫清除過(guò)程中,IL-2、IFN-γ可促進(jìn)CD+3、CD+4的含量,提高腫瘤細(xì)胞的抗原提呈能力,促進(jìn)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力;同時(shí)誘導(dǎo)CD+8的產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生靶向殺傷作用[8]。黏附分子B7是T細(xì)胞活化、增殖的重要共刺激信號(hào),可促進(jìn)T細(xì)胞的活化增殖。本研究發(fā)現(xiàn),西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量可顯著提高IL-2、IFN-γ的水平及CD+3、CD+8、B7-1的含量,說(shuō)明西黃丸乙酸乙酯提取物可提高荷瘤機(jī)體的免疫清除功能。

研究表明,IL-6、IL-10、TGF-β是形成腫瘤免疫抑制微環(huán)境的重要因子,具有抑制免疫和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用。腫瘤組織通過(guò)高分泌IL-6,誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng),且多種惡性腫瘤與IL-6表達(dá)呈正相關(guān)[9]。IL-10可以通過(guò)抑制抗原提呈細(xì)胞的提呈作用[10]。TGF-β可以抑制機(jī)體的多重抗腫瘤效應(yīng),抑制淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2,促進(jìn)血管生成等[11]。本研究發(fā)現(xiàn)高劑量西黃丸乙酸乙酯提取物可顯著降低IL-6、TGF-β的水平,發(fā)揮提高腫瘤細(xì)胞免疫原性,激活淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤作用,進(jìn)一步增強(qiáng)免疫清除功能,提示西黃丸乙酸乙酯提取物可能具有逆轉(zhuǎn)免疫逃逸的作用。有關(guān)西黃丸抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)及其逆轉(zhuǎn)免疫抑制狀態(tài)的分子作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

表2 7組大鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群及B7-1的檢測(cè)值Tab.2 The detection results of peripheral blood lymphocyte subset and B7-1 in seven groups of rats ±s,%,n=10

表2 7組大鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群及B7-1的檢測(cè)值Tab.2 The detection results of peripheral blood lymphocyte subset and B7-1 in seven groups of rats ±s,%,n=10

與模型對(duì)照組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with model control group,*1P＜0.05,*2P＜0.01

組別大鼠/只劑量/(mg·kg-1)CD+3CD+4CD+8B7-1(CD80)正常對(duì)照組100.080.95±5.25*149.94±4.29*131.02±4.06*142.07±6.96*1模型對(duì)照組100.041.25±2.9119.09±3.1422.13±2.0814.49±5.19西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量組10108.657.37±3.25*227.99±2.5629.38±2.73*228.26±3.05*2中劑量組1043.555.06±3.7424.14±4.0030.92±4.03*124.39±3.29*2低劑量組1021.746.61±4.3621.94±3.8724.67±3.6416.63±4.24西黃丸高劑量組101 37058.98±5.56*231.99±3.1026.99±5.7025.83±2.12*2香菇多糖組1023058.84±4.51*230.69±2.0328.15±3.73*221.93±5.07*2

表3 7組大鼠外周血IL-2、IL-6、IL-10的檢測(cè)值Tab.3 The detection results of IL-2,IL-6 and IL-10 in peripheral blood in seven groups of rats ng·L-1,±s

表3 7組大鼠外周血IL-2、IL-6、IL-10的檢測(cè)值Tab.3 The detection results of IL-2,IL-6 and IL-10 in peripheral blood in seven groups of rats ng·L-1,±s

與模型對(duì)照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別大鼠/只劑量/(mg·kg-1)IL-2IL-6IL-10正常對(duì)照組100.0218.33±15.87*141.79±7.39*148.68±3.43*1模型對(duì)照組100.0147.86±12.07103.96±8.5793.19±2.45西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量組10108.6195.45±11.24*260.42±6.18*285.34±3.76中劑量組1043.5183.39±10.93*283.30±7.8384.73±4.48低劑量組1021.7162.02±12.7685.69±9.0287.46±3.59西黃丸高劑量組101 370190.62±10.90*272.60±7.63*270.30±5.08*2香菇多糖組10230187.80±8.09*277.81±7.21*285.24±2.04

表4 7組大鼠外周血TGF-β、IFN-γ的檢測(cè)值Tab.4 The detection results of TGF-β and IFN-γ in peripheral blood in seven groups of rats ng·L-1,±s,n=10

表4 7組大鼠外周血TGF-β、IFN-γ的檢測(cè)值Tab.4 The detection results of TGF-β and IFN-γ in peripheral blood in seven groups of rats ng·L-1,±s,n=10

與模型對(duì)照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別劑量/(mg·kg-1)TGF-βIFN-γ正常對(duì)照組0.0139.02±12.61*1267.42±11.65*1模型對(duì)照組0.0221.22±13.75195.08±6.95西黃丸乙酸乙酯提取物高劑量組108.6162.35±10.17*2251.28±7.33*1中劑量組43.5185.46±8.89225.55±9.58低劑量組21.7206.08±9.26203.83±6.79西黃丸高劑量組1 370170.48±6.51*2246.80±10.38*2香菇多糖組230183.57±7.46243.38±8.61*2

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.008

Antitumor Effects of Ethyl Acetate Extract from Xihuang Pills

MA Jie1,YANG Wei2,GUAN Shuo2,HU Jun-xia2,GAO Wen-bin3,ZENG Chang-qian2,LIANG Wen-bo2
(1.Zunyi Medical College,Zunyi 563000,China;2.Medical College of Dalian University,Dalian 116622, China;3.Department of Oncology,Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University,Dalian,116000,China)

Objective This research aimed to study the antitumor activity and immunologic function of ethyl acetate extracts fromχihuangpills on tumor-bearing rats.MethodsThe Walker256 bearing rats were randomly divided into 7 groups (n=10):normal control,model control,different doses of ethyl acetate extracts fromχihuangpills,and lentinan plus high dose ofχihuangpill groups.After the drug administration for a consecutive 14 days,the inhibitory rate of tumor was measured.FCM method was used in determination of serum levels ofB7-1.ELISA method was applied in measuring serum levels of IL-2,IL-6,IL-10,TGF-β and IFN-γ.ResultsThe ethyl acetate extract fromχihuangpills effectively inhibited the growth of Walker256 by 30.41%.Compared with the model control,serum levels of IL-2,IFN-γ andB7-1 were significantly higher(P＜0.05),and those of IL-6 and TGF-β were significantly lower(P＜0.05)in the high doseχihuangpill ethyl acetate extracs group.No significant difference in the level ofand IL-10 was found in the control.ConclusionThe ethyl acetate extracts fromχihuangpills is one of the active constituent parts for inhibition of tumor growth by elevating IL-2,IFN-γ and,B7-1 and reducing IL-6 and TGF-β.

Xihuangpill;Ethyl acetate extract;Mammary cancer;Tumor;Cytokine

R286;R965

A

1004-0781(2014)03-0303-04

2013-06-20

2013-07-22

*大連金州新區(qū)科技計(jì)劃(2012-A1-046)

馬杰(1988-),男,湖北十堰人,碩士,主要從事中藥抗腫瘤藥理研究。電話:0411-87403952,E-mail：429671086@qq.com。

梁文波,男,教授,研究方向:中藥抗腫瘤藥理。電話:0411-87403409,E-mail：dllwb@126.com。