何志國(guó)，趙永忠，盧青，周英瓊，肖緒華，侯巧燕，黃大健，成秋宸

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1.消化內(nèi)科;2.病理科，桂林 541004)

荔枝核總黃酮對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響*

何志國(guó)1，趙永忠1，盧青1，周英瓊2，肖緒華1，侯巧燕2，黃大健1，成秋宸1

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1.消化內(nèi)科;2.病理科，桂林 541004)

目的 探討荔枝核總黃酮(TFL)對(duì)膽管阻塞型肝纖維化大鼠肝組織Toll樣受體4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)表達(dá)的影響。方法雄性SPF級(jí)SD大鼠80只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組。除正常對(duì)照組外,其余各組均采用膽總管結(jié)扎法(CBDL)制備肝纖維化大鼠模型。造模后第2天開(kāi)始,正常對(duì)照組、模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃(5 mL·kg-1),TFL小劑量組給予TFL 100 mg·kg-1、TFL大劑量組給予TFL 200 mg·kg-1灌胃,均每天1次,共4周,第4周末處死大鼠,留取肝臟組織。蘇木精-伊紅(HE)染色、Masson染色觀察大鼠肝組織病理學(xué)改變,免疫組化法(IHC)檢測(cè)TLR4、NF-κB在4組大鼠肝組織內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果與模型組比較,TFL大劑量組肝組織纖維化程度明顯減輕,膠原表達(dá)明顯減少(P＜0.01);正常對(duì)照組、模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組的大鼠肝組織TLR4免疫組化評(píng)分分別為(0.4±0.5),(3.3±0.6),(3.1±0.5),(1.4±0.5)分;NF-κB免疫組化評(píng)分分別為(0.80± 0.77),(5.12±0.89),(4.68±0.70),(3.47±0.61)分,模型組TLR4、NF-κB表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組和TFL大劑量組(P＜0.01),與TFL小劑量組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論TLR4和NF-κB高表達(dá)可能與膽管阻塞型大鼠肝纖維化的發(fā)生發(fā)展有關(guān),大劑量荔枝核總黃酮可能通過(guò)抑制大鼠肝組織TLR4、NK-κB的表達(dá)來(lái)改善膽管阻塞型大鼠肝纖維化程度。

荔枝核總黃酮；肝纖維化；Toll樣受體4；核因子-κB

肝纖維化是指以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟內(nèi)過(guò)度沉積,是多種慢性肝病共有的、漸進(jìn)性的病理階段,其中細(xì)胞因子的表達(dá)異常在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。Toll樣受體(toll-like receptors,TLRs)作為細(xì)胞膜上的跨膜信號(hào)傳遞分子,可通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與配體介導(dǎo)的肝臟內(nèi)多種細(xì)胞的激活及多種細(xì)胞因子的分泌,在肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制中具有重要的作用[1]。核因子κB(nuclear factor-kappa-B,NF-κB)位于TLR下游信號(hào)通路的樞紐位置,細(xì)胞受到生物刺激后激活NF-κB,活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的表達(dá),參與炎癥反應(yīng)及肝纖維化過(guò)程[2]。荔枝核提取物具有行氣散結(jié)、驅(qū)寒止痛之功效。近年的研究表明,荔枝核總黃酮(total flavone of Litchi Chinensis Sonn,TFL)是荔枝核中具有藥理活性的主要成分之一,具有抗病毒[3-4]、抗肝損傷[5]和抗氧化[6]等作用?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明,姜黃素及TFL均具有抗膽管阻塞型大鼠肝纖維化作用[7-9]。迄今為止,有關(guān)肝纖維化過(guò)程中TLR4蛋白在肝組織內(nèi)表達(dá)的情況鮮有報(bào)道。筆者在本研究中以膽總管結(jié)扎所致大鼠肝纖維化模型為研究對(duì)象,進(jìn)一步探討TFL對(duì)膽管阻塞型大鼠肝組織中TLR4和NF-κB表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)雄性SD大鼠80只,體質(zhì)量(200± 20)g,由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(桂)2007-0001。TLR4、NF-κB蛋白檢測(cè)所用Ⅰ抗為兔抗小鼠多克隆抗體,均購(gòu)自Bioworld公司,Ⅱ抗為辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)羊抗兔IgG,購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。超敏發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所。即用型SP試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。TFL由桂林工學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室加工提取,經(jīng)檢測(cè)TFL含量為852 g·kg-1,將其粉末狀物用純化水稀釋成40 g·L-1溶液。

1.2 動(dòng)物分組及處理 參照文獻(xiàn)[10]制備膽總管阻塞性肝纖維化大鼠模型,將80只SD大鼠隨機(jī)分成4組,即正常對(duì)照組、模型組、TFL小劑量組和TFL大劑量組,每組20只。模型組大鼠1%戊巴比妥鈉(4 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后正中開(kāi)腹,游離膽總管,雙重結(jié)扎,兩結(jié)扎線(xiàn)中間剪斷后關(guān)腹。正常對(duì)照組大鼠游離膽總管而不結(jié)扎,關(guān)腹。其余組同模型組。術(shù)后第2天開(kāi)始分組給藥。①正常對(duì)照組:0.9%氯化鈉溶液灌胃,5 mL·kg-1·d-1;②模型組:同正常對(duì)照組;③TFL小劑量組:TFL灌胃,100 mg·kg-1·d-1;④TFL大劑量組:TFL灌胃,200 mg·kg-1·d-1。均每天1次,共4周,第4周末全部處死,留取各組肝臟組織。

1.3 肝臟組織病理學(xué)檢查 取相同部位肝臟,用4%甲醛固定,石蠟包埋,切片,行蘇木精-伊紅(hematoxylineosinstaining,HE)染色,光鏡下觀察肝臟病理變化并參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行分期。常規(guī)Masson染色,膠原纖維組織染成綠色,每張切片隨機(jī)選取高倍視野5個(gè),Leica Qwin V3圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司)計(jì)算每個(gè)視野膠原纖維面積。

1.4 采用免疫組化法(IHC)檢測(cè)TLR4、NF-κB的表達(dá) 嚴(yán)格按照SP試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。I抗稀釋濃度1∶100。參考文獻(xiàn)[12]對(duì)各蛋白在肝組織中的陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,分析前行正態(tài)性檢驗(yàn)方差齊性檢驗(yàn),如符合條件,采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的單因素方差分析,不符合條件,采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 本實(shí)驗(yàn)共有9只大鼠死亡,均不進(jìn)入統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。膽總管結(jié)扎后大鼠活動(dòng)及攝食減少,精神萎靡,1～6 d后,耳朵、眼睛、雙爪出現(xiàn)黃染,尿液呈濃茶色,取模型組大鼠肝臟組織時(shí),發(fā)現(xiàn)其肝臟呈深黃色,變形且增大,表面結(jié)節(jié)樣改變,邊緣圓鈍,膽管擴(kuò)張膨出伴膽汁淤積,質(zhì)硬。

2.2 各組大鼠肝組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果 HE染色(圖1)見(jiàn)正常對(duì)照組大鼠肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞排列整齊,無(wú)炎癥壞死及纖維增生。模型組大鼠肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)及肝細(xì)胞索排列紊亂,大量肝細(xì)胞壞死,肝實(shí)質(zhì)內(nèi)及膽管周?chē)梢?jiàn)不同程度的膠原沉積,匯管區(qū)、匯管區(qū)之間、匯管區(qū)與中央靜脈之間小膽管彌漫性增生,部分可見(jiàn)假小葉形成,病理分期以Ⅲ、Ⅳ期為主;TFL小劑量組匯管區(qū)小膽管增生明顯,纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂,較TFL大劑量組明顯,但不及模型組,以Ⅲ、Ⅳ期為主;TFL大劑量組匯管區(qū)增生較模型組明顯縮小,偶見(jiàn)點(diǎn)、灶狀壞死,纖維組織增生減少,肝小葉結(jié)構(gòu)趨于正常,中央靜脈周?chē)?jiàn)少量膠原沉積,匯管區(qū)周?chē)w維化,界限清楚,病理分期以Ⅰ、Ⅱ期為主, TFL大劑量組肝纖維化程度明顯低于模型組。Masson染色結(jié)果(圖2)提示模型組膠原纖維面積與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),TFL大劑量組膠原纖維面積與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),TFL小劑量組膠原纖維面積與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組肝纖維化程度分期及膠原纖維面積具體數(shù)值見(jiàn)表1,2。

表1 4組大鼠肝組織肝纖維化程度分期結(jié)果Tab.1 Stage results of liver fibrosis in 4 groups of rats 只

表2 4組大鼠Masson染色膠原纖維面積計(jì)算結(jié)果Tab.2 Collagen fiber area of liver tissue by Masson staining in 4 groups of rats ±s

表2 4組大鼠Masson染色膠原纖維面積計(jì)算結(jié)果Tab.2 Collagen fiber area of liver tissue by Masson staining in 4 groups of rats ±s

與模型組比較,*1P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.01

組別大鼠/只膠原纖維面積/μm2TFL小劑量組161 092.7±105.2大劑量組19772.9±168.9*1模型組161 172.5±108.4正常對(duì)照組20377.4±19.8

2.3 IHC檢測(cè)肝組織TLR4、NF-κB的表達(dá) TLR4主要表達(dá)于肝細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及膽管上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。正常對(duì)照組肝組織內(nèi)TLR4蛋白呈陰性或弱陽(yáng)性表達(dá),模型組肝組織中TLR4的蛋白的表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組,呈淡黃色、棕黃色或棕褐色染色,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。TFL小劑量組肝組織內(nèi)TLR4蛋白陽(yáng)性表達(dá)低于模型組,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。TFL大劑量組肝組織內(nèi)TLR4蛋白表達(dá)較模型組明顯降低,大部分以淡黃色染色為主,偶見(jiàn)棕黃色及棕褐色染色,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。NF-κB的表達(dá):正常對(duì)照組及TFL大劑量組大鼠肝組織內(nèi)僅呈弱陽(yáng)性表達(dá),而在模型組及TFL小劑量組肝組織細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核可觀察到明顯棕色顆粒,NF-κB呈強(qiáng)陽(yáng)性。各組免疫組織評(píng)分及化學(xué)染色見(jiàn)表3和圖3,4。

圖1 4組大鼠肝組織HE染色(×200)A.正常對(duì)照組;B.模型組;C.TFL小劑量組;D.TFL大劑量組Fig.1 HE staining on liver tissue of 4 groups of rats(×200)A.normal control group,B.model group,C.low-dose TFL group,D.high-dose TFL group

圖2 4組大鼠肝組織Masson染色(×100)A.正常對(duì)照組;B.模型組;C.TFL小劑量組;D.TFL大劑量組Fig.2 Masson staining on liver tissue of 4 groups of rats(×100)A.normal control group;B.model group;C.low-dose TFL group;D.high-dose TFL group

表3 4組大鼠肝組織TLR4與NF-κB免疫組化評(píng)分結(jié)果Tab.3 Results of TLR4、NF-κB expressions in liver tissue by immunohistochemical staining 分,±s

表3 4組大鼠肝組織TLR4與NF-κB免疫組化評(píng)分結(jié)果Tab.3 Results of TLR4、NF-κB expressions in liver tissue by immunohistochemical staining 分,±s

與模型組比較,*1P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.01

組別大鼠/只TLR4NF-κB TFL小劑量組163.1±0.54.68±0.70大劑量組191.4±0.5*13.47±0.61*1模型組163.3±0.65.12±0.89正常對(duì)照組200.4±0.50.80±0.77

3 討論

本研究采用膽總管結(jié)扎法復(fù)制類(lèi)似人膽汁淤積性肝纖維化的大鼠模型,該模型具有操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、造模時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。本研究結(jié)果表明模型組全部大鼠肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)及肝細(xì)胞索排列紊亂,大量肝細(xì)胞壞死,肝實(shí)質(zhì)內(nèi)及膽管周?chē)梢?jiàn)不同程度的膠原沉積,匯管區(qū)、匯管區(qū)之間、匯管區(qū)與中央靜脈之間小膽管彌漫性增生,部分可見(jiàn)假小葉形成,提示模型復(fù)制成功。采用大劑量TFL干預(yù)后,大鼠肝纖維化程度減輕,匯管區(qū)增生明顯縮小,偶見(jiàn)點(diǎn)、灶狀壞死,纖維組織增生減少,肝小葉結(jié)構(gòu)趨于正常,而TFL小劑量組在肝組織病理學(xué)變化、減少肝組織膠原沉積上與模型組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明大劑量TFL對(duì)膽汁淤積性肝纖維化大鼠有顯著的治療作用。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示,模型組大鼠TLR4、NF-κB的表達(dá)明顯升高,而TFL大劑量組表達(dá)較低,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明TLR4的過(guò)度表達(dá)可能激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路,參與了肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展,而大劑量TFL對(duì)其表達(dá)有一定抑制作用。其機(jī)制可能為膽總管結(jié)扎術(shù)后大鼠出現(xiàn)梗阻性黃疽,會(huì)導(dǎo)致腸道屏障功能下降,庫(kù)否細(xì)胞功能受損,細(xì)菌位移入血,細(xì)菌及其產(chǎn)物造成的毒血癥,導(dǎo)致腸源性?xún)?nèi)毒素血癥發(fā)生,誘導(dǎo)了肝組織內(nèi)TLR4的高表達(dá),引起下游傳導(dǎo)信號(hào)NF-κB的活化和核內(nèi)轉(zhuǎn)移。大劑量TFL可下調(diào)肝組織內(nèi)TLR4的表達(dá),有效抑制NF-κB的激活,減少了免疫反應(yīng)與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子表達(dá)所致的HSC的活化增殖,發(fā)揮抗肝纖維化作用[13-19]。

圖3 4組大鼠肝組織TLR4蛋白免疫組織化學(xué)染色(SP法×400)A.正常對(duì)照組;B.模型組;C.TFL小劑量組;D.TFL大劑量組Fig.3 Immunohistochemical staining on TLR4 protein in liver tissue of 4 groups of rats(SP×400)A.normal control group;B.model group;C.low-dose TFL group;D.high-dose TFL group

圖4 4組大鼠肝組織NF-κB免疫組織化學(xué)染色(SP法×400)A.正常對(duì)照組;B.模型組;C.TFL小劑量組;D.TFL大劑量組Fig.4 Immunohistochemical staining on NF-κB in liver tissue of 4 groups of rats(SP×400)A.normal control group;B.model group;C.low-dose TFL group;D.high-dose TFL group

綜上所述,隨著肝纖維化程度的加重,TLR4、NF-κB在大鼠肝纖維化組織細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中表達(dá)均明顯增加,而大劑量TFL可能通過(guò)降低肝組織中TLR4、NF-κB的表達(dá)而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。這為抗肝纖維化的新藥開(kāi)發(fā)及TLR4/NF-κB信號(hào)通路的理論研究提供了新的方向。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.004

Effect of Total Flavone from Litchi chinensis Sonn on the Expression of TLR4 and NF-κB in Livers of Rats with Hepatic Fibrosis

HE Zhi-guo1,ZHAO Yong-zhong1,LU Qing1,ZHOU Ying-qiong2,XIAO Xu-hua1,HOU Qiao-yan2, HUANG Da-jian1,CHENG Qiu-chen1
(1.Department of Gastroenterology;2.Department of Pathology,the Affiliated Hospital of Guilin Medical College,Guilin 541004,China)

Objective To investigate the effects of total flavone ofLitchi chinensisSonn(TFL)on TLR4 and NF-κB expression in the livers of rats with hepatic fibrosis.MethodsEighty male SD rats were randomly divided into four groups:normal control,model control,TFL at low-dose(100 mg·kg-1·d-1)and high-dose(200 mg·kg-1·d-1).The model of liver fibrosis in rats was induced by ligating common bile duct(CBDL)for all rats except for the normal controls.The rats were treated with TFL and 0.9%physiological saline in the tested,the normal and model groups,respectively once a day for 4 weeks.All rats were sacrificed in the end,and the livers were collected for histopathological studied by hematoxylin-eosin(H&E)staining and Masson Trichrome(MT)examination.The expressions of TLR4 and NF-κB in livers of above four groups were detected by immune-histologic chemistry(IHC).ResultsCompared with the model group,significantly milder liver fibrosis and lower collagen expression were found in the high-dose of TFL treated group(P＜0.01).The score of TLR4 expression in the normal and model groups,TFL at low-dose and high-dose was(0.4±0.5),(3.3±0.6),(3.1±0.5),(1.4±0.5),and that of NF-κB was (0.80±0.77),(5.12±0.89),(4.68±0.70),and(3.47±0.61),respectively.The protein expression of TLR4 and NF-κB in the model group was significantly higher than that in the normal control and TFL high-dose group(P＜0.01),but had no obvious difference from the lower dose group.ConclusionHigher expression of TLR4 and NF-κB may be involved in the liver fibrogenisis and development by CBDL in rats.TFL at high-dose may improve liver fibrosis induced by CBDL via inhibiting the expression of TLR4 and NF-κB in hepatic tissue in rats.

Total flavone ofLitchi chinensisSonn;Hepatic fibrosis;Toll-like receptor 4;NF-κB

R286;R965

A

1004-0781(2014)03-0286-05

2013-05-10

2013-06-20

*廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012GXNSFAA053105);廣西壯族自治區(qū)教育廳科研資助項(xiàng)目(201012MS172);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360659)

何志國(guó)(1978-),男,湖北隨州人,主治醫(yī)師,碩士,主要從事消化內(nèi)科專(zhuān)業(yè)工作。E-mail：hezhiguo429001@21cn.com。

趙永忠(1968-),男,廣西桂林人,主任醫(yī)師,教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向:慢性肝病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：zyz-1968@163.com。