李予，潘萍，2，陳曉莉，李琳，李軼，楊冬梓＊

（1．中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院生殖中心，廣州 510120；2．廣東省計劃生育?？漆t(yī)院生殖科，廣州 510600）

在輔助生殖技術領域，薄型子宮內膜的治療一直是一個非常棘手的難題，子宮內膜菲薄的不孕患者助孕效果欠佳，妊娠幾率降低［1－3］。迄今為止，薄型子宮內膜無公認最有效的治療方法，生殖醫(yī)學工作者探索了各種各樣的方法，包括大劑量雌激素、低劑量阿司匹林、陰道用西地那非、己酮可可堿、維生素E和促性腺激素釋放激素激動劑等，但療效報道不一［4－8］。

2011年Gleicher等［9］首次報道應用粒細胞集落刺激因子（G-CSF）治療薄型子宮內膜獲得較好結果，但細胞因子作為一種治療薄型子宮內膜的新方法，其有效性尚有待更多的臨床研究。因此，本研究在凍融胚胎移植（FET）周期對子宮內膜菲薄的患者宮腔灌注G-CSF，旨在探討G-CSF對治療結局的影響。

資料與方法

一、研究對象和FET內膜準備方案

選擇2011年8月至2012年12月在中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院生殖中心行FET治療且排卵日或黃體酮／HCG注射日最大子宮內膜厚度≤7mm的69例患者進入本研究。FET內膜準備方案包括自然周期、激素替代周期和誘發(fā)排卵周期，根據患者排卵和內膜的生長情況進行方案選擇：對于月經規(guī)律、排卵正常者，首選自然周期；若內膜生長不良，下周期改用激素替代周期，如果仍然發(fā)現內膜過薄，最后選擇誘發(fā)排卵周期；對于月經不規(guī)則、排卵障礙者，首選激素替代周期，若內膜生長不良，誘發(fā)排卵周期作為二線治療。低劑量阿司匹林和維生素E是內膜菲薄患者的常規(guī)輔助用藥，個別患者陰道用西地那非。

二、內膜監(jiān)測

對于自然周期行FET的不孕患者，根據月經周期情況，在預計排卵前2～5d進行連續(xù)的陰道超聲檢查和尿黃體生成素（LH）監(jiān)測，直至卵泡成熟和排卵。對于激素替代周期行FET者，從月經來潮第3天起口服補佳樂（廣州拜耳醫(yī)藥）2mg／d，超聲監(jiān)測內膜厚度，根據內膜反應每4d逐漸遞增藥物劑量，直至最大劑量12mg／d；對于誘發(fā)排卵周期行FET者，從月經來潮第3天起口服他莫昔芬（上海復旦復華藥業(yè)）20mg／d，連用5d，后續(xù)聯合應用人絕經期促性腺激素（HMG，珠海麗珠制藥）75IU／d。超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育和內膜厚度，適時應用HCG刺激排卵。

超聲下內膜厚度的測量：在子宮正中矢狀面內膜強回聲與肌層交界處測得最大前后徑，當內膜厚度≤7mm時，重復測量3次，取平均值。若在自然周期排卵日、或激素替代周期黃體酮注射日、或誘發(fā)排卵周期HCG注射日內膜厚度≤7mm，則診斷為薄型子宮內膜。

三、宮腔灌注G-CSF

對于內膜厚度≤7mm的患者，給予以下建議：（1）取消本周期，下周期調整內膜準備方案；（2）繼續(xù)胚胎移植。對于堅持要求胚胎移植者，建議其應用G-CSF治療，但患者的選擇不影響其后續(xù)治療方案。其中，41例選擇了G-CSF治療并簽署書面的知情同意書，在排卵日或黃體酮／HCG注射日宮腔灌注100μg（0．6mL）的人重組 G-CSF（商品名瑞白TM，山東齊魯制藥），28例不接受G-CSF治療。

宮腔灌注G-CSF方法：常規(guī)外陰陰道消毒后，用1mL注射器連接COOK一次性人工授精管，抽吸0．6mLG-CSF，并將其緩慢注入宮腔。

所有患者常規(guī)應用黃體酮（廣州白云山明興制藥）40mg／d轉化子宮內膜，3～5d后移植凍融胚胎。

四、分組及觀察指標

主要觀察指標是每個移植周期的胚胎種植率和臨床妊娠率?？紤]到患者年齡和胚胎質量對種植率和妊娠率的影響，年齡＞40歲或無優(yōu)質胚胎移植者不納入最后的統(tǒng)計分析。根據Istanbul的胚胎形態(tài)學評價標準［11］，評分1級的卵裂期胚胎和評分3級或5級的D5囊胚視為優(yōu)質胚胎。因此，10例患者未納入分析，其中7例進行了G-CSF治療，3例未進行。在納入最后分析的59例患者中，34例進行了G-CSF治療，其中40個應用G-CSF治療的周期作為G-CSF組，49個既往周期作為自身對照組，同期25例未應用G-CSF治療的80個周期作為對照組。

五、統(tǒng)計學方法

使用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料采用獨立樣本t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。P值＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、基本臨床資料

所有患者的臨床資料總結詳見表1。年齡、孕次、不孕類型、不孕年限、體重指數（BMI）、激素水平、新鮮IVF周期數、新鮮IVF周期內膜厚度、新鮮IVF周期薄型子宮內膜的比例以及不孕因素等在應用G-CSF治療和未應用G-CSF的患者之間均無統(tǒng)計學差異（P＞0．05）。11例患者新鮮IVF周期內膜厚度正常，但新鮮周期助孕后發(fā)生了流產。在FET周期7例應用G-CSF治療，4例未應用。

二、內膜準備方案和治療結局比較

誘發(fā)排卵周期和自然周期所占比例在G-CSF組分別為30．00%和12．50%，自身對照組分別為8．16% 和 28．57%，對 照 組 分 別 為 16．25% 和33．75%。與自身對照組或對照組相比，G-CSF組誘發(fā)排卵周期比例高，自然周期比例低，有顯著差異（P＜0．05）；而自身對照組和對照組的內膜準備方案無統(tǒng)計學差異（P＝0．255）。三組患者周期取消率依次為：自身對照組69．39%，對照組48．75%，G-CSF組17．50%，有顯著差異（P＜0．05）（表2）。

表1 患者基本臨床資料［（±s），n（%）］

表1 患者基本臨床資料［（±s），n（%）］

組 別 n 年齡（歲） 孕次 原發(fā) 繼發(fā) 不孕年限（年） BMI（kg／m2不孕類型）4．26±2．91 20．83±2．88無 G-CSF治療 25 31．96±3．65 1．16±1．07 8（32．00） 17（68．00） 5．72±4．02 20．95±2．91 G-CSF治療 34 30．91±3．51 1．21±1．23 11（32．35） 23（67．65）薄型內膜G-CSF治療 34 7．83±2．25 5．96±4．72 196．79±174．03 1．44±0．82 7．77±1．61 21（42．86）組 別 n 基礎FSH（U／L）基礎LH（U／L）基礎E2（pmol／L）新鮮IVF周期周期數（n）內膜厚度（mm）無 G-CSF治療 25 7．10±1．44 6．43±4．12 162．03±71．97 1．40±0．71 7．78±1．46 18（51．43）組 別 n不孕因素盆腔／輸卵管異位癥G-CSF治療 34 27（79．41） 19（55．88） 8（23．53） 7（20．59） 1（2．94） 1（2．94）因素 男方因素 宮腔因素 多囊卵巢綜合征 不明原因 子宮內膜無 G-CSF治療 25 17（68．00） 18（72．00） 10（40．00） 6（24．00） 1（4．00） 1（4．00）

表2 各組FET周期內膜準備方案和治療結局［（±s），n（%）］

表2 各組FET周期內膜準備方案和治療結局［（±s），n（%）］

注：D0＝排卵日或黃體酮／HCG注射日；D3＝排卵或黃體酮／HCG注射后72h；D5＝排卵或黃體酮／HCG注射后120h；與G-CSF組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．001；與自身對照組相比，＃P＜0．05

治療方案組 別 n自然周期 激素替代周期 誘發(fā)排卵周期D0內膜厚度（mm）取消周期（%）完成周期數（n）移植胚胎數（n）6．51±0．69 17．50 33 2．48±0．57自身對照組 49 14（28．57）＊ 31（63．27）＊ 4（8．16）＊ 6．26±1．41 69．39＊＊ 15 2．53±0．52對照組 80 27（33．75）＊ 40（50．00）＊ 13（16．25）＊ 6．42±0．91 48．75＊＃ 41 2．56±0．55 G-CSF組 40 5（12．50） 23（57．50） 12（30．00）組 別 n 復蘇率（%） 胚胎種植／ET 臨床妊娠／ET 流產（n）移植胚胎D3 D凍融胚胎5異位妊娠（n）2 0 1 0自身對照組 49 33（86．84） 5（13．16） 95．56±11．73 3（7．89） 3（20．00） 2 1對照組 80 91（86．67） 14（13．33） 92．93±13．04 14（13．33） 12（29．27）G-CSF組 40 62（75．61） 20（24．39） 93．94±15．55 13（15．85） 10（30．30）

D0（排卵日或黃體酮／HCG注射日）內膜厚度、移植胚胎數、D3／D5胚胎、凍融胚胎復蘇率、每個移植周期的胚胎種植率和臨床妊娠率，三組間均無統(tǒng)計學差異（P＞0．05）。與自身對照組相比，G-CSF組胚胎種植率（15．85%vs．7．89%）和臨床妊娠率（30．30%vs．20．00%）表現出升高的趨勢，但未達顯著差異（P＞0．05）（表2）。

由于流產和異位妊娠病例數非常少，本研究未進行組間的比較。在G-CSF組，22個周期在胚胎移植日測量子宮內膜厚度，在G-CSF宮腔灌注前后內膜厚度無顯著性差異（6．53±0．65mm vs．6．75±1．17mm，P＝0．403）。

討 論

足夠厚度的子宮內膜對于維持正常妊娠的重要性毋庸置疑。雖然內膜厚4mm也有成功妊娠的個案報告［12］，但大量的臨床實踐證明內膜厚度≤7mm時，妊娠幾率降低。Dix等［2］報道內膜厚度≤5mm時新鮮或凍融胚胎移植的臨床妊娠率為8．5%，Singh等［3］報道內膜厚度 ＜6mm 和 6～8mm的妊娠率分別為3．7%和14．8%。

最近，有學者創(chuàng)新性地將細胞因子引入薄型子宮內膜的治療，受到人們關注。2011年Gleicher等［9］首次報道4例子宮內膜菲薄的不孕患者應用G-CSF治療，均成功獲得妊娠。隨后，他們進行了一項隊列研究，21例平均年齡高達40．5歲的不孕患者采用G-CSF治療，平均內膜厚度從6．4mm增厚至9．3mm，臨床妊娠率為19．1%［10］。這兩項研究都是在卵巢刺激周期應用G-CSF，本研究則不同，是在FET周期應用G-CSF，藥物劑量（100μg／0．6mL）低于文獻報道（300μg／mL）。此外，本研究在排卵日或黃體酮／HCG注射日應用G-CSF，治療時機較為統(tǒng)一，并選擇未應用G-CSF的患者作為對照組，而 Gleicher等［9，10］的研究缺乏對照組，G-CSF治療時機存在差異，在4例個案報告中，G-CSF在胚胎移植前2～9d應用，而在隊列研究中，21例患者中有3例（14．3%）接受了第2次G-CSF灌注，其余85．7%的患者只接受單次灌注。

在本組資料中，與自身對照組或對照組相比，G-CSF組誘發(fā)排卵周期比例高，自然周期比例低，而前兩組內膜準備方案無差異。換而言之，應用G-CSF治療的患者內膜環(huán)境可能更不理想，以致在FET進行內膜準備時，不得不放棄自然周期而選擇更多的人工方法調整內膜。在相似的內膜準備方案下，自身對照組周期取消率顯著高于對照組，也提供了佐證，提示G-CSF治療的患者內膜情況較差，正是由于較高的周期取消率，這些患者更傾向于嘗試新方法來改善內膜生長。

與自身對照組相比，G-CSF組胚胎種植率由7．89%提高至15．85%，臨床妊娠率由20．00%提高至30．30%，但兩組患者的胚胎種植率和臨床妊娠率并無顯著差異。原因分析如下：首先，本研究樣本量較小，各組完成的FET周期數偏少；其次，GCSF治療劑量較小，若采用文獻報道的藥物劑量，研究結果可能有所不同；最后，若G-CSF宮腔灌注次數增多，而不僅僅是在排卵日或黃體酮／HCG注射日單次應用，治療效果可能會出現累積或疊加效應。Gleicher等［9，10］報道 G-CSF灌注后48h內內膜厚度明顯增厚，而本研究并未觀察到內膜厚度的這種明顯變化。在嘗試應用G-CSF的初期階段，我們著重關注G-CSF能否有效地改善薄型子宮內膜患者的治療效果和妊娠結局，所以研究納入的每位患者并沒有在G-CSF治療后都測量內膜厚度，臨床資料有欠完整，將來累積病例資料后再行分析比較。

我們知道，G-CSF是功能很強的刺激骨髓造血細胞增殖分化的細胞因子，人們較少意識到，其實G-CSF還可以作用于人體內多種成熟細胞，促進并維持其正常的生理功能。在女性生殖方面，G-CSF被證實參與卵泡生長發(fā)育、排卵、卵巢刺激和妊娠等多個環(huán)節(jié)［13－16］。此外，研究還發(fā)現人子宮內膜和母胎界面均有 G-CSF及其受體的表達［17－19］。在整個妊娠期間，母體血清G-CSF維持在一個較高的水平［13］。妊娠早期和足月分娩時，胎兒絨毛組織和母體蛻膜組織都可以分泌 G-CSF［19］。這些研究為G-CSF的臨床應用提供了理論依據，然而，外源性宮腔灌注的G-CSF是如何在內膜組織發(fā)揮作用以及影響內膜容受性和胚胎種植，目前尚無涉及該方面的機理研究。我們推測，外源性G-CSF作為化學刺激物，宮腔灌注作為機械刺激，可能激活內分泌－旁分泌作用途徑，誘發(fā)內源性多種細胞因子分泌，從而影響內膜容受性和胚胎種植。

關于G-CSF應用的安全性，本研究沒有觀察到任何副反應，可能因為G-CSF治療是低劑量，并且經宮腔灌注局部應用。文獻報道G-CSF主要的不良反應是流感樣癥狀，而且非常輕微［20］。慢性中性粒細胞減少癥患者需要長期應用G-CSF，包括妊娠期間，有研究數據表明這些患者的妊娠結局以及出生子代的生長發(fā)育未受藥物影響［21］，同樣地，Scarpellini等［22］對不明原因復發(fā)性流產患者應用G-CSF治療，也無不良反應報道。

總而言之，本研究提示G-CSF治療未能顯著改善子宮內膜菲薄的不孕患者的胚胎種植率和臨床妊娠率，但不足之處在于這是一項回顧性、非隨機化、小樣本的臨床資料總結。鑒于G-CSF是一種探索性的治療方法，仍需要前瞻性隨機對照研究來驗證其療效。今后我們將繼續(xù)在臨床應用過程中不斷摸索不同的治療劑量和治療時機，以期尋找GCSF行之有效的治療模式。

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