韓樹標(biāo)，韓偉，黃國(guó)寧

（重慶市婦幼保健院，重慶 400013）

以體外受精－胚胎移植（IVF-ET）為代表的人類輔助生殖技術(shù)為廣大不育不孕患者提供了生育自己孩子的可能。但是在目前的IVF中仍有約1%～10%的病例會(huì)發(fā)生受精完全失?。?］。IVF受精失敗不僅僅影響輔助生殖技術(shù)的成功率，同時(shí)也給患者帶來巨大的心理及經(jīng)濟(jì)壓力。目前IVF實(shí)驗(yàn)室針對(duì)不明原因不育或者其他可能存在受精失敗的患者，一般采取IVF和卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）分半（Half-ICSI），或者短時(shí)受精結(jié)合早期補(bǔ)救ICSI（即授精后5～6h補(bǔ)救ICSI）等措施來避免完全受精失敗的出現(xiàn)。在這些措施中應(yīng)用較多的是短時(shí)受精結(jié)合早期補(bǔ)救ICSI方法，獲得了較好的成功率，挽救了部分受精失敗的周期。本文主要從短時(shí)受精對(duì)臨床結(jié)局的影響、卵母細(xì)胞受精失敗的判斷、實(shí)施早期補(bǔ)救ICSI的時(shí)機(jī)等影響補(bǔ)救ICSI臨床治療成功率方面探討補(bǔ)救ICSI技術(shù)在人類輔助生殖技術(shù)的臨床應(yīng)用。

一、短時(shí)受精對(duì)臨床結(jié)局的影響

實(shí)施補(bǔ)救ICSI的前提是短時(shí)受精，即授精后早期拆除顆粒細(xì)胞觀察是否受精，以便于挽救受精失敗的周期。但是與常規(guī)受精相比，短時(shí)受精的受精率以及對(duì)胚胎發(fā)育的影響有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

首先，哺乳動(dòng)物自然受精是一個(gè)嚴(yán)格有序的生理過程，主要包括：精卵識(shí)別、精子發(fā)生頂體反應(yīng)并穿過透明帶、精子與卵子質(zhì)膜融合、卵子皮質(zhì)反應(yīng)與多精入卵的阻止以及雌雄原核的形成融合并最終啟動(dòng)卵裂［2］。根據(jù)這一生理過程，早期人類輔助生殖技術(shù)中一般采用精卵共培養(yǎng)16～18h后，然后拆除顆粒細(xì)胞觀察是否受精，又稱為常規(guī)受精。常規(guī)受精作為一種傳統(tǒng)的受精方式，由于操作簡(jiǎn)便一直為大多數(shù)生殖中心采用。但Gianaroli等［3］的研究表明，長(zhǎng)時(shí)間的精卵共孵育可能會(huì)產(chǎn)生高的活性氧（ROS）影響胚胎質(zhì)量。同時(shí)，胚胎暴露于ROS環(huán)境中可能會(huì)導(dǎo)致透明帶的硬化，而損傷胚胎的種植潛能［4］。Gianaroli等［5］研究表明，精卵共孵育4h與15min相比，穿過顆粒細(xì)胞層抵達(dá)卵母細(xì)胞周圍的精子數(shù)量并無顯著增加。這些結(jié)果表明，受精過程中長(zhǎng)時(shí)間的精卵共孵育可能是沒必要的，同時(shí)還會(huì)影響胚胎質(zhì)量。

其次，相對(duì)于常規(guī)受精，短時(shí)受精更符合人體的自然受精過程。正常的人類精卵相互作用和受精發(fā)生在性交后20min內(nèi)，完成精卵結(jié)合、精子穿過透明帶、開始受精、皮質(zhì)反應(yīng)以及透明帶硬化等一系列生理事件。在自然受精過程中，雖然一次性交會(huì)射出大量精子，但僅有極少數(shù)精子可以抵達(dá)卵母細(xì)胞，只有一個(gè)精子進(jìn)入卵母細(xì)胞完成受精。短時(shí)受精后胚胎脫離精子移入新的培養(yǎng)環(huán)境中，更符合正常受精后胚胎周圍的微環(huán)境。Suresh等［6］研究表明，與過夜受精相比精卵共孵育2h受精可顯著提高胚胎質(zhì)量、臨床妊娠率以及胚胎種植率。張寧媛等［7］通過自身對(duì)照的方式研究短時(shí)受精與常規(guī)過夜受精對(duì)受精結(jié)局的影響，結(jié)果表明，3h精卵共孵育不影響受精結(jié)局。Xiong等［8］2011年的研究表明，與20h組相比，精卵共孵育6h不影響正常受精率和臨床結(jié)局。2013年Zhang等［9］對(duì)近幾年的文章進(jìn)行系統(tǒng)薈萃分析，結(jié)果提示，與常規(guī)受精相比，短時(shí)受精可以提高臨床妊娠率和胚胎種植率。綜上，短時(shí)受精可以與常規(guī)受精一樣安全有效地應(yīng)用于人類輔助生殖技術(shù)。

二、受精失敗判斷及早期補(bǔ)救ICSI

受精失敗的判斷是實(shí)施早期補(bǔ)救ICSI的關(guān)鍵步驟，因?yàn)橹挥性谠缙趯?duì)卵母細(xì)胞受精與否進(jìn)行精確判斷，才可以實(shí)施早期補(bǔ)救ICSI。在常規(guī)IVF受精過程中，受精的判斷是在加精后20h左右，雌雄原核形成后，主要根據(jù)雌雄原核的個(gè)數(shù)結(jié)合第二極體情況，判斷是否受精。

短時(shí)受精與否的判斷標(biāo)準(zhǔn)是第二極體的排出，第二極體的判斷主要受實(shí)驗(yàn)室胚胎技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)等的影響（圖1）。

圖1 短時(shí)受精后第二極體排出情況

其次，受精后的觀察時(shí)機(jī)也是影響第二極體觀察的最重要因素。Van den Bergh等［10］研究表明，受精后2h有56．6%的卵母細(xì)胞排出第二極體，到了3h第二極體的排出率將增加到78．3%。南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院對(duì)常規(guī)IVF受精的正常受精周期，回顧性分析第二極體排出時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)授精后3h即有78．7%的卵母細(xì)胞排出第二極體，到了6h第二極體的排出比率可以增加到92．9%［11］。提示成熟度適當(dāng)?shù)穆涯讣?xì)胞如果受精，在6h應(yīng)該排出第二極體。因此，早期受精判斷為完全受精失敗是有依據(jù)的。

一旦受精失敗，患者將可能由于沒有可移植胚胎而被迫取消周期，將給患者帶來巨大的心理及經(jīng)濟(jì)壓力，同時(shí)也增加了臨床醫(yī)生的壓力。2003年Chen等［12］率先提出早期補(bǔ)救的理念并應(yīng)用于臨床治療，將補(bǔ)救ICSI的時(shí)間定在加精后6h，通過對(duì)第二極體排出作為早期判斷受精與否的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)無第二極體的卵母細(xì)胞實(shí)施補(bǔ)救。結(jié)果表明，補(bǔ)救后受精率及臨床結(jié)局均有顯著提高。南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院2006～2008年的早期補(bǔ)救ICSI新鮮胚胎移植周期的妊娠率為57．3%［11］。顯而易見早期補(bǔ)救ICSI技術(shù)可以作為受精失敗的補(bǔ)救措施。

三、補(bǔ)救ICSI時(shí)機(jī)

目前一般是在授精后5～6h實(shí)施早期補(bǔ)救ICSI。Sirard等［13］的研究表明，授精5h后，大部分卵母細(xì)胞已經(jīng)趨于老化，錯(cuò)過了受精的最佳時(shí)機(jī)，雖然此時(shí)實(shí)施補(bǔ)救ICSI不會(huì)影響雌雄原核的形成，但是維持胚胎正常分裂的一些細(xì)胞因子或mRNA發(fā)生了降解或修飾，從而失去了原有功能，而影響胚胎的發(fā)育速度和質(zhì)量，甚至?xí)绊懪咛サ陌l(fā)育潛能。我們中心的數(shù)據(jù)也顯示，實(shí)施補(bǔ)救ICSI的時(shí)機(jī)與臨床結(jié)局呈負(fù)相關(guān)，即補(bǔ)救ICSI時(shí)機(jī)越早，其臨床結(jié)局越好［14］。因此，在可能的條件下，應(yīng)盡量提前對(duì)確定不受精的卵母細(xì)胞實(shí)施補(bǔ)救ICSI。

綜上所述，對(duì)于可能存在受精失敗的周期，采用短時(shí)受精不影響其卵母細(xì)胞正常受精，且可通過早期觀察，判斷受精是否成功。為受精失敗的周期實(shí)施早期補(bǔ)救ICSI，可挽救部分由于受精失敗而導(dǎo)致取消的周期。

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