王曉霞，張文寧，王正德，劉云穎，閆 慧

（內(nèi)蒙古科技大學化學與化工學院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

氯諾昔康-銅(Ⅱ)-牛血清白蛋白三元配合物的熒光光譜法研究

王曉霞，張文寧，王正德，劉云穎，閆 慧

（內(nèi)蒙古科技大學化學與化工學院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

在生理條件下，用熒光光譜法研究了氯諾昔康對牛血清白蛋白，銅(Ⅱ)對牛血清白蛋白以及銅(Ⅱ)對氯諾昔康和牛血清白蛋白熒光光譜特性的影響。銅(Ⅱ)和氯諾昔康均可使牛血清白蛋白的熒光強度發(fā)生猝滅，在銅(Ⅱ)存在下,氯諾昔康對牛血清白蛋白的熒光猝滅作用顯著增強。根據(jù)熒光猝滅雙倒數(shù)圖計算氯諾昔康和牛血清白蛋白之間的結(jié)合常數(shù)是5.43×105，結(jié)合位點數(shù)是1.14。銅(Ⅱ)和牛血清白蛋白之間的結(jié)合常數(shù)是2.10×105，結(jié)合位點數(shù)是0.78。

熒光光譜法；牛血清白蛋白（BSA）；銅（Ⅱ）；氯諾昔康；三元配合物

氯諾昔康為非甾體類消炎鎮(zhèn)痛藥，系噻嗪類衍生物。它通過抑制環(huán)氧合酶（COX）的活性來抑制前列腺素合成，具有較強的鎮(zhèn)痛和抗炎作用[1]。

銅是生命元素之一，人體缺銅會導致失眠，血液中膽固醇增高，引起冠心病，心血管功能降低，會出現(xiàn)記憶減退，思維混亂，反應遲鈍等癥狀[2]。

血漿中含量最豐富的載體蛋白是血清白蛋白，許多內(nèi)源化合物及其藥物與它的相互作用已廣泛被研究[3-4]。文獻中對氯諾昔康、血清白蛋白和金屬離子三元配合物體系的研究較少。本文通過熒光光譜法研究了氯諾昔康、牛血清白蛋白和銅(Ⅱ)三元配合物的熒光特性，并且確定了結(jié)合反應的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-4600型熒光分光光度儀，HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋。

牛血清白蛋白（BSA），氯諾昔康，三羥甲基氨基甲烷（Tris），鹽酸，氯化鈉，氯化銅（均為分析純）。實驗用水為去離子二次蒸餾水，無熒光雜質(zhì)。

BSA溶液：以pH=7.0，0.05mol·L-1的Tris-HCl溶液配制成濃度為1.0×10-5mol·L-1，以0.1mol·L-1NaCl維持離子強度。

氯諾昔康溶液：以pH=7.0，0.1 mol·L-1的Tris-HCl溶液配制成濃度為1.0×10-5mol·L-1，以0.1mol·L-1NaCl維持離子強度。

CuCl2溶液：1×10-2mol·L-1，1×10-3mol·L-1，1×10-4mol·L-1pH=7的Tris-HCl緩沖溶液。

1.2 試驗方法

(1) 分別取一定量的BSA（1.0×10-5mol·L-1），[BSA]∶[1×10-4mol·L-1Cu2+]=1∶1的混合物，BSA與氯諾昔康（濃度1∶1），Cu2+和BSA-氯諾昔康（1∶1）以及氯諾昔康（1.0×10-5mol·L-1）于1cm比色皿中，以熒光激發(fā)波長為280nm，發(fā)射波長狹縫寬度為5nm，測定346nm處的熒光發(fā)射光譜強度（圖1）。

(2)取1mL 1.0×10-5mol·L-1BSA溶液分別加入到9個相同的10mL比色管中，再逐次加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL 1.0×10-5mol·L-1的氯諾昔康，二次水定容至刻度，搖勻，以相同的參數(shù)分別測定該系列熒光發(fā)射強度，結(jié)果見表1。

（3）取1mL 1.0×10-5mol·L-1BSA溶液分別加入到9個相同的10mL比色管中，逐次加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 1.0×10-4mol·L-1的Cu2+，二次水定容至刻度，充分搖勻，以相同的參數(shù)分別測定該系列熒光發(fā)射強度，結(jié)果見表2。

圖1 熒光發(fā)射光譜Fig.1 Emission spectra of samples spectrum

（4）在（2）中的比色管中分別加入1×10-2mol·L-1的Cu2+1mL和1×10-3mol·L-1的Cu2+1mL，水定容至刻度，搖勻，放置10min后用激發(fā)波長283 nm測定其熒光發(fā)射光譜(圖2、圖3)并得出熒光強度結(jié)果（表3）。

2 結(jié)果與討論

2.1 氯諾昔康和銅（Ⅱ）對BSA的猝滅作用

由于蛋白質(zhì)中色氨酸和酪氨酸的存在使其具有內(nèi)源熒光，以283nm激發(fā)波長為，在300～500 nm的范圍內(nèi)，氯諾昔康在314nm處（圖1e）有最大發(fā)射峰，而BSA的最大發(fā)射波長為341nm（圖1a），在BSA中分別加入Cu2+和氯諾昔康后，BSA的最大發(fā)射峰位置不變，但熒光強度明顯降低（圖1b，圖1c），當氯諾昔康和Cu2+同時加入時BSA的熒光強度又進一步降低，這說明BSA和Cu2+之間，BSA和氯諾昔康之間以及三者都存在時它們產(chǎn)生了作用，發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，可見Cu2+和氯諾昔康對BSA的熒光產(chǎn)生猝滅作用。

2.2 氯諾昔康對BSA的猝滅作用

熒光猝滅分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅。在動態(tài)猝滅過程中，用KSV（動態(tài)猝滅常數(shù)）來描述猝滅劑與熒光體熒光強度之間的相互作用關系，以動態(tài)猝滅的Stern-Volmer方程[5]處理，即：

式中F0是沒有加入氯諾昔康時BSA的熒光強度，F(xiàn)是加入一定量氯諾昔康時BSA的熒光強度，Kq是雙分子猝滅過程速率常數(shù)，τ0是猝滅劑不存在時生物大分子的平均壽命，生物大分子的熒光壽命約為10-9s，[Q]為猝滅劑即氯諾昔康的濃度。由表1可知，隨著氯諾昔康濃度的增大BSA的最大熒光發(fā)射峰強度逐漸降低，這表明氯諾昔康加入后對BSA產(chǎn)生了熒光猝滅作用。

表1 氯諾昔康對BSA的熒光光譜影響Tab.1 Effect of LNXC concentration on fluorescence spectrum of BSA

溫度對BSA的影響，可由公式：得Ksv(25℃)=4.839×105L·mol-1，Ksv(35℃）=4.249× 105L·mol-1，Ksv(45℃)=3.615×105L·mol-1，可知隨溫度的升高Ksv減小，從而初步表明猝滅過程為靜態(tài)猝滅。以F0/F對CLNXC作出氯諾昔康對BSA的熒光猝滅圖Stern-Voimer(圖2)，圖2中曲線有較為良好的線性關系， 根據(jù)實驗及公式（2）所得Ksv=6.07× 105L·mol-1代入公式（1）得Kq=6.07×1013L·mol-1·s-1，遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1，所以氯諾昔康對BSA的猝滅是靜態(tài)猝滅。根據(jù)靜態(tài)猝滅方程：

式中K為白蛋白分子與藥物的結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點數(shù)。以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖(圖3)。

圖2 LNXC濃度對F0/F方程圖Fig.2 plot ofF0/Fversus concentration of LNXC

由直線的斜率和截距得結(jié)合常數(shù)K=6.54×105，結(jié)合位點數(shù)n=1.23，可見二者之間的結(jié)合作用很強，且可形成一個結(jié)合位點。

圖3 lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖Fig.3 Plot of lg[(F0-F)/F] versusconcentration of LNXC

2.3 銅（Ⅱ）對BSA的猝滅作用

由實驗可知，隨著Cu2+濃度增大BSA的最大熒光發(fā)射峰也降低了（表2）,這說明Cu2+對BSA也有熒光猝滅作用。同樣的用動態(tài)猝滅的Stern-Volmer方程 處理，用表2的F0/F對CCu2+做Cu2+對BSA的熒光猝滅圖Stern-Voimer，所得結(jié)果見圖4。圖4中曲線也有很好的線性關系, 根據(jù)實驗及公式（2）所得Ksv=1.51×105L·mol-1代入公式（1）得Kq=1.51×1013L·mol-1·s-1，也遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1，所以Cu2+對BSA的猝滅也是靜態(tài)猝滅。

圖4 Cu(Ⅱ)濃度對F0/F方程圖Fig.4 plot of F0/F versus concentration of Cu(II)

以lg[(F0-F)/F]對lg[Cu2+]作圖（圖5），得一直線方程為y= 0.7664x-0.6775，r=0.9984，由截距和斜率得結(jié)合常數(shù)K=2.1×105，結(jié)合位點數(shù)n=0.77，可見結(jié)合常數(shù)也比較大，說明二者之間也具有很強的結(jié)合作用，說明[Cu2+]的存在可能會對氯諾昔康與BSA體系產(chǎn)生不可忽略的影響。

圖5 lg[(F0-F)/F]對lg[Cu2+]作圖Fig.5 Plot of lg[(F0-F)/F] versusconcentration of[Cu2+]

2.4 氯諾昔康與BSA作用的熱力學參數(shù)和作用力類型的確定

實驗中研究了不同溫度下氯諾昔康與血清白蛋白的相互作用，并根據(jù)熱力學常數(shù)確定了氯諾昔康-BSA體系的作用力類型。通?！鱏＞0為疏水作用力的表現(xiàn)；△H＜0，△S＞0為靜電作用力的特征；△H＜0，△S＜0為氫鍵和笵德華力的特點[6-7]。

由以下公式：

在體系氯諾昔康-BSA中，依據(jù)不同溫度下的結(jié)合常數(shù)K求得：△H均為-9.93kJ·mol-1，△S25℃=76.44J·mol-1·K-1；△S35℃=76.42J·mol-1·K-1；△S45℃=76.10J·mol-1·K-1，從而證明氯諾昔康與BSA的相互作用力為靜電作用力。

2.5 銅（Ⅱ）對BSA與氯諾昔康結(jié)合作用的影響

表2列出了不同濃度的Cu2+對BSA與氯諾昔康的熒光光譜的影響。

表2 不同Cu (Ⅱ)濃度下BSA和LNXC的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)Table 2 Binding constant Kand the number of binding siten between BSA and LNXC in the presence of different concentration of Cu (Ⅱ)

表2表明，隨著Cu(Ⅱ)濃度的增大，BSA與LNXC結(jié)合作用增強，提高了結(jié)合常數(shù)，表明Cu (Ⅱ)、BSA與LNXC之間形成了三元配合物。

3 結(jié)論

研究了不同溫度下氯諾昔康與牛血清白蛋白作用的熒光特性，證明氯諾昔康與BSA的相互作用力為靜電作用力，同時也證實了氯諾昔康對BSA的猝滅是靜態(tài)猝滅。比較不同濃度銅離子存在下BSA與LNXC的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點，結(jié)果表明，隨著Cu(Ⅱ)濃度的增大，BSA與LNXC結(jié)合作用增強，提高了結(jié)合常數(shù)，表明Cu (Ⅱ) 、BSA與LNXC之間形成了三元配合物。

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Study on Ternary Complex of Lornoxicam, Copper(Ⅱ)and BSA by Method of Fluorescence

WANG Xiao-xia, WANG Zheng-de, LIU Yun-ying
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014010, China)

Under the physiological conditions, fluorescence spectrometry was used to study bovine serum albumin, copper (Ⅱ ) of bovine serum albumin and copper (Ⅱ ) on bovine serum albumin fluorescence spectrum characteristics. Copper (Ⅱ ) and lornoxicam could both cause bovine serum albumin fluorescence quenched. Under the existence of copper (Ⅱ ), lornoxicam enhanced the fluorescence quenching effect of bovine serum albumin. According to lineweaver-burk plot calculation, the combining constant between lornoxicam and bovine serum albumin was 5.43×105, position points were 1.14. The combining constant between Copper (Ⅱ) and bovine serum albumin was 2.10×105, position points were 0.78.

fluorescence spectroscopy；bovine serum albumin (BSA)；copper (Ⅱ)；lornoxicam；ternary complexes；

O 657.3

A

1671-9905(2014)04-0015-04

教育部“春暉計劃”基金資助項目(2009-1-01040)；內(nèi)蒙古教育廳高校科研基金項目(NJZY11145)；內(nèi)蒙古科技大學創(chuàng)新基金資助項目(2012NCL034)；內(nèi)蒙古科技大學大學生創(chuàng)新基金項目

王曉霞（1984-），女，內(nèi)蒙古包頭市人，講師，碩士，研究方向：藥物化學，電話：(0472）5951561，E-mail:wxx572369@163.com

2014-02-19