韓敏

(西安文理學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，陜西西安 710065)

葉綠素屬于卟啉類化合物［1］，是重要的天然色素，廣泛存在于植物和某些動(dòng)物體內(nèi)，常作為著色劑或添加劑應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日用化工等領(lǐng)域［2-4］。我國(guó)養(yǎng)蠶歷史悠久，是世界蠶業(yè)的發(fā)源地和主產(chǎn)國(guó)［5-6］，而且研究表明，蠶沙中葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.8% ～1.0%，高于綠色植物中的含量［7］。但由于葉綠素的穩(wěn)定性差，故將葉綠素合成其衍生物，如葉綠素鐵鈉鹽［8］、葉綠素鋅鈉鹽［9］、葉綠素銅鈉鹽［10］等。

葉綠素銅鈉鹽是一種略帶胺味的墨綠色結(jié)晶性粉末，具有光亮的色澤、無(wú)毒、穩(wěn)定性良好的特點(diǎn)，且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，在食品和日用化工中有很廣泛的運(yùn)用。

傳統(tǒng)葉綠素銅鈉鹽的制備是先用有機(jī)溶劑提取葉綠素然后濃縮再皂化［11］，工藝路線較長(zhǎng)，成本高。本研究將葉綠素的提取與皂化合并，研究了直接皂化法制備葉綠素銅鈉鹽的最佳工藝條件，并與傳統(tǒng)的工藝作了比較。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

蠶沙，陜西安康旬陽(yáng);95%乙醇、氫氧化鈉、石油醚、硫酸、硫酸亞銅、無(wú)水乙醇均為分析純。

KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器;7230G型可見(jiàn)分光光度計(jì);R201L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;IS50型傅里葉紅外光譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將市售的蠶沙于40～50℃烘干后，用粉碎機(jī)粉碎后備用。

1.2.2 葉綠素直接提取皂化、濃縮 稱取干蠶沙粉10 g，于250 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水，軟化20 min。加入95%乙醇100 mL，并用10%NaOH調(diào)節(jié)體系pH值為12，放在超聲波清洗器中，在70℃超聲處理2 h。冷卻至室溫，取樣分析。提取皂化反應(yīng)后，把溶液減壓濃縮，回收溶劑乙醇。

1.2.3 萃取除雜 將濃縮后的溶液倒入分液漏斗中，加入1∶1的石油醚，進(jìn)行萃取除雜，然后將墨綠色的皂化液轉(zhuǎn)入三口燒瓶中，棄去上層雜質(zhì)。多萃取幾次，回收萃取劑石油醚。

1.2.4 酸化置銅 將萃取液用6 mol/L H2SO4調(diào)節(jié) pH2～3，60 ℃酸化30 min，加入10%CuSO4溶液6 mL反應(yīng)120 min，使葉綠素銅酸顆粒充分析出。過(guò)濾，依次用30℃蒸餾水和30%乙醇溶液洗滌，直至濾液呈中性為止。濾餅在60℃烘干得到純凈的葉綠素銅酸。

1.2.5 成鹽 用丙酮將純凈的葉綠素銅酸溶解，用10%NaOH-CH3CH2OH調(diào)節(jié)溶液pH≈12使葉綠素銅酸成鹽析出，在60℃下烘干，得到具有光亮的色澤、無(wú)毒、穩(wěn)定性良好的葉綠素銅鈉鹽。

1.3 葉綠素含量的測(cè)定

吸取0.45 mL用石油醚萃取后的溶液于10 mL容量瓶中，加入95%乙醇至刻度線，在649 nm和665 nm處測(cè)定其吸光度值。計(jì)算公式如下［11］:

葉綠素 a濃度 Ca=13.97A665－6.89A649

葉綠素 b 濃度 Cb=24.95A649－7.30A665

葉綠素總濃度C總=Ca+Cb

葉綠素提取率=C總×V溶液×稀釋倍數(shù)/M樣品

2 結(jié)果與討論

2.1 體系pH對(duì)葉綠素含量的影響

反應(yīng)條件同1.2節(jié)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 體系pH對(duì)葉綠素含量的影響Fig.1 The influence of the system of pH on the chlorophyll content

由圖1可知，當(dāng)pH≈12時(shí)，葉綠素的含量趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增加堿的用量，葉綠素含量不再降低。所以，應(yīng)將體系pH值維持在12左右。

2.2 超聲時(shí)間對(duì)葉綠素含量的影響

反應(yīng)條件同1.2節(jié)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠素含量降低較快，≥120 min時(shí)，葉綠素含量降低趨于平緩。原因可能是:①皂化反應(yīng)本身就是一個(gè)可逆反應(yīng)，在某一時(shí)間會(huì)達(dá)到平衡狀態(tài);②葉綠素在溫度比較高的條件下會(huì)分解，在120～180 min，葉綠素的緩慢降低是由于葉綠素被氧化分解變性了。所以，超聲時(shí)間應(yīng)控制在120 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)葉綠素含量的影響Fig.2 The influence of ultrasonic time on the chlorophyll content

2.3 超聲溫度對(duì)葉綠素含量的影響

反應(yīng)條件同1.2節(jié)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)葉綠素含量的影響Fig.3 The influence of ultrasonic temperature on the chlorophyll content

由圖3可知，超聲溫度在70℃以上時(shí)，皂化液中的葉綠素降低趨于平緩。原因可能是:溫度升高，動(dòng)態(tài)反應(yīng)平衡向右移動(dòng)，而70℃時(shí)反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，此時(shí)繼續(xù)增加溫度，產(chǎn)品得率增加平緩，而且還會(huì)使葉綠素降解。因此，超聲溫度以70℃為宜。

2.4 加銅量對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)量的影響

反應(yīng)條件同1.2節(jié)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 加銅量對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)量的影響Fig.4 The influence of dosage of copper on the product production

由圖4可知，隨著10%CuSO4溶液量的增加，葉綠素銅鈉鹽的產(chǎn)量也在增加，當(dāng)10%CuSO4增加到6 mL時(shí)，葉綠素銅鈉鹽的產(chǎn)量增長(zhǎng)幅度變得的很小，如果繼續(xù)加入10%CuSO4溶液，不僅增加成本，而且還對(duì)后期污水的處理增加工作量。所以，加入10%CuSO4溶液為6 mL。

2.5 置銅時(shí)間對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)量的影響

反應(yīng)條件同1.2節(jié)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 置銅時(shí)間對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)量的影響Fig.5 The influence of time on the product production

由圖5可知，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可以有效地增加產(chǎn)品的產(chǎn)量，但120 min后，產(chǎn)量快速降低。因此，選擇置銅時(shí)間為120 min。

2.6 置銅溫度對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)量的影響

反應(yīng)條件同1.2節(jié)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 置銅溫度對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)量的影響Fig.6 The influence of temperature on the product production

由圖6可知，升高溫度，可以有效地增加產(chǎn)品的產(chǎn)量，但65℃以上時(shí)繼續(xù)升高溫度，葉綠素銅鈉鹽的產(chǎn)量反而降低。原因可能是:①隨著溫度的升高溶劑的揮發(fā)，會(huì)使生成的葉綠素銅酸的濃度也增大，該置銅反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，產(chǎn)物濃度增大會(huì)使反應(yīng)逆向進(jìn)行，從而使已經(jīng)生成的葉綠素銅酸又被分解;②葉綠素銅酸的溶解度隨著溫度的升高而增大，溫度過(guò)高不能使葉綠素銅酸完全析出來(lái)，而是溶解在溶液里。所以，綜合考慮選取65℃為酸化置銅最優(yōu)溫度。

2.7 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取pH值、超聲溫度、置銅時(shí)間和加銅量，采用4因素3水平進(jìn)行。正交實(shí)驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal test

由表2可知，影響葉綠素銅鈉鹽制備諸因素的主次關(guān)系為:體系pH＞置銅時(shí)間＞置銅量＞超聲溫度。制備葉綠素銅鈉鹽的最優(yōu)條件為A2B3C3D2，加堿使皂化體系pH≈12，置銅時(shí)間為150 min，置銅量為6 mL，超聲溫度為80℃。

2.8 對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8.1 傳統(tǒng)制備法 稱取干蠶沙粉10 g于250 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水軟化20 min。加入95%乙醇100 mL，放置在超聲波清洗器中，在70℃下超聲時(shí)間120 min。將提取液轉(zhuǎn)入250 mL三口燒瓶中，用10%NaOH調(diào)節(jié)pH≈12，水浴溫度為70℃，皂化120 min。用 6 mol/L H2SO4調(diào)節(jié) pH 2～3，65℃下酸化30 min，加入6 mL 10%CuSO4溶液，置銅時(shí)間150 min。最后用10%NaOH-CH3CH2OH調(diào)節(jié)溶液，使葉綠素銅酸成鹽析出。

2.8.2 直接皂化法 稱取干蠶沙粉10 g于250 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水軟化20 min。加入95%乙醇100 mL，并用10%NaOH調(diào)節(jié)pH≈12，放置在超聲波清洗器中，在70℃下超聲時(shí)間120 min。用等量石油醚萃取3次，萃取液轉(zhuǎn)入250 mL三口燒瓶中，用6 mol/L H2SO4調(diào)節(jié) pH 2～3，65℃下酸化30 min。加入 6 mL 10%CuSO4溶液，置銅時(shí)間150 min。用10%NaOH-CH3CH2OH調(diào)節(jié)溶液，使葉綠素銅酸成鹽析出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the comparison experiment

由表3可知，直接皂化法葉綠素銅鈉鹽的得率大于傳統(tǒng)制備法葉綠素銅鈉鹽的得率，而且比傳統(tǒng)制備法少一道工序，因此直接皂化法是可行的。

2.9 產(chǎn)品分析

2.9.1 產(chǎn)品性狀 制備的葉綠素銅鈉鹽是一種略帶胺味的墨綠色結(jié)晶性粉末，具有光亮的色澤、無(wú)毒、穩(wěn)定性良好的特點(diǎn)，極易溶于水，呈透明鮮綠色;微溶于CH3CH2OH和氯仿，幾乎不溶于石油醚和無(wú)水乙醚。

2.9.2 紫外-可見(jiàn)光譜(UV-Vis)分析 見(jiàn)圖7。

圖7 葉綠素銅鈉鹽的UV-Vis譜圖Fig.7 UV-Vis spectrum of the copper sodium chlorophyll

由圖7可知，產(chǎn)品的最大吸收波長(zhǎng)為413 nm和628 nm，與從竹葉中提取的葉綠素銅鈉鹽［12］的最大吸收波長(zhǎng)基本上一致。

2.9.3 紅外光譜(FTIR)分析 見(jiàn)圖8。

圖8 葉綠素銅鈉鹽的FTIR譜圖Fig.8 FTIR spectrum of the copper sodium chlorophyll

3 結(jié)論

以蠶沙為原料，采用直接皂化法制備葉綠素銅鈉鹽的最優(yōu)工藝參數(shù)為:10 g干蠶沙粉先在pH 12的體系中，80℃下超聲120 min;再于pH 2～3的體系中，65℃下酸化30 min，加入6 mL 10%CuSO4溶液，置銅150 min，最后用10%NaOH-CH3CH2OH調(diào)節(jié)溶液使葉綠素銅酸成鹽析出。在此條件下，葉綠素銅鈉鹽的產(chǎn)率為2.12%，比傳統(tǒng)制備法要高。

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