馬令利，戴兆云，張芳，彭子飛

(1.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234;2.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院，上海 200040)

亞油酸(LA)是含有雙鍵的十八碳二烯，作為機(jī)體最重要的必須脂肪酸，亞油酸具有人體維生素地位［1］。它的靶向肝癌作用可能性較大，把具有抗癌活性的化合物結(jié)合上去，可構(gòu)建亞油酸抗癌藥物靶向治療體系。亞油酸作為抗癌藥物靶向的載體，與具有相對(duì)肝癌選擇性的單克隆抗體、某些親肝癌蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)鐵蛋白)［2］、脂質(zhì)體、納米材料、特異胞膜受體抑制劑等其他靶向制劑載體［3］相比，化學(xué)結(jié)構(gòu)較為簡單，不易受到破壞，半衰期較長，而且無免疫原性和蛋白抗原性，生物相容性良好，適合面廣等優(yōu)點(diǎn)［4］。因此，亞油酸作為肝癌靶向制劑載體，為腫瘤靶向藥物的創(chuàng)制開拓了新思路。

去氧氟尿苷是5-氟尿嘧啶的衍生物，屬抗代謝類抗腫瘤藥［5］。它作為胸腺嘧啶合成酶等的抑制劑，可抑制腫瘤細(xì)胞DNA的生物合成，體內(nèi)體外均證實(shí)該藥物可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡或凋亡［6-7］。由于其療效確鑿、抗瘤譜廣，所以近50年來，一直是臨床應(yīng)用中高效抗癌藥物，目前已有多種烷基酯的去氧氟脲苷前藥［8-9］，并且已經(jīng)證實(shí)對(duì)癌細(xì)胞有很好的選擇性［10］。但去氧氟尿苷熔點(diǎn)高，脂溶性和水溶性都很差，限制了它的實(shí)際應(yīng)用范圍。而去氧氟尿苷的羥基是重要活性基團(tuán)，可與脂肪酸形成脂肪酸醇酯，將亞油酸與氟脲苷上戊糖的第5位或第3位游離羥基縮合為酯，合成亞油酸去氧氟尿苷酯的共價(jià)化合物，預(yù)計(jì)該化合物可在有關(guān)酯酶的催化作用下，緩慢釋放氟脲苷，長期抑制腫瘤生長。本文闡述了亞油酸去氧氟尿苷酯的合成方法，并用1H NMR及LCMS表征。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

亞油酸(99%);去氧氟脲苷;DMAP、DCC、NaHCO3、飽和食鹽水、無水硫酸鎂、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷均是分析純。

AM-500型核磁共振儀(CDCl3作為溶劑，SiMe4作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn));黃海GF254薄層色譜板;6410B高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酯化反應(yīng) 在25 mL圓底燒瓶中加入一定量亞油酸與去氧氟尿苷，使之溶于8 mL干燥后的溶劑二氯甲烷中，形成摩爾比為1∶1.2反應(yīng)底物，并加入等摩爾比DMAP，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，在室溫下磁力攪拌10 min，加入等摩爾比DCC，室溫下反應(yīng)一定時(shí)間后，取樣用于產(chǎn)物分析。

將產(chǎn)物過濾，去除白色沉淀物。濾液進(jìn)行稀釋，過濾掉稀釋后產(chǎn)生的沉淀 DCU。將濾液用飽和NaHCO3水溶液洗滌3次，再用飽和食鹽水洗滌3次，用無水硫酸鎂干燥1 h后過濾。濾液減壓蒸餾除去溶劑得到粘稠狀液體。用二氯甲烷稀釋后作薄層色譜分析。

1.2.2 薄層層析法分析 用點(diǎn)樣毛細(xì)管(0.5 mm)取反應(yīng)稀釋液在預(yù)制的硅膠薄層板上點(diǎn)樣，同時(shí)以去氧氟尿苷、亞油酸兩種原料為對(duì)照，展開劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1，顯色劑為碘蒸氣。

在紫外燈下刮下有產(chǎn)物的硅膠，用二氯甲烷洗出，抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去二氯甲烷溶劑，殘留物待測(cè)定。

1.2.3 硅膠柱層析分離產(chǎn)物 硅膠柱層析條件:洗脫劑為 V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1，流速為1滴/s，收集洗脫液，并隨時(shí)用薄層色譜法檢測(cè)產(chǎn)物。收集到的目標(biāo)產(chǎn)物減壓蒸餾，得到粘稠狀液體。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析條件

1.3.1 液相部分 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，柱溫 22 ℃;流動(dòng)相為甲醇/水，流動(dòng)相梯度為2 min，甲醇50%;20 min，甲醇95%;流速 0.8 mL/min;進(jìn)樣量 10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜部分 干燥氣溫度350℃，干燥氣流量6.0 L/min，霧化器壓力20 psi，毛細(xì)管電壓350 V(+);采集方式為SIM。

2 結(jié)果與討論

2.1 薄層層析分析

通過多次實(shí)驗(yàn)，根據(jù)溶劑洗脫順序，選擇了V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1展開劑系統(tǒng)，分析結(jié)果見圖1。

圖1 反應(yīng)混合物分析Fig.1 The analysis of mixture

由圖1可知，與原料相比，反應(yīng)液在薄層層析板上部有新的物質(zhì)出現(xiàn)，初步判定此物質(zhì)為目標(biāo)產(chǎn)物。不同成分的 Rf值:Rf1=0.15，Rf2=0.40，Rf3=0.72，Rf4=0.83。根據(jù)Rf值可進(jìn)行硅膠柱層析。

2.2 硅膠柱層析分析

將薄層色譜條件轉(zhuǎn)至硅膠柱層析分離。硅膠柱層析分離得到的目標(biāo)產(chǎn)物的TLC分析見圖2。

圖2 目標(biāo)產(chǎn)物分析Fig.2 The analysis of target product

由圖2可知，經(jīng)過硅膠柱分離后，薄層層析板上只有一種新物質(zhì)出現(xiàn)。由此可知，硅膠柱層析分離可以得到較為純凈的目標(biāo)產(chǎn)物。

2.3 核磁共振波譜分析

目標(biāo)產(chǎn)物的1H NMR見圖3。

圖3 目標(biāo)產(chǎn)物的氫譜分析Fig.3 1H NMR of target product

1H NMR(500 MHz，CDCl3，δ):7.41(d，1H，J=6.5 Hz)，8.72(s，1H)，6.3(t，1H)5.40(m，4H)，5.21(d，1H)，4.45(q，1H)，4.29 ～ 4.17(m，2H)，2.82(t，2H)，2.35 ～ 2.42(q，2H)，2.15 ～ 2.05(m，4H)，1.65(m，2H)，1.38 ～ 1.27(m，14H)，0.91(t，3H)。

2.4 質(zhì)譜分析

目標(biāo)產(chǎn)物的MS分析見圖4。

亞油酸去氧氟尿苷酯的分子量是508.6，由圖4可知，質(zhì)譜圖中出現(xiàn)的509.2峰為［M+H］質(zhì)信號(hào)，由此可以斷定，TLC圖中出現(xiàn)的新物質(zhì)為亞油酸去氧氟尿苷酯。

圖4 目標(biāo)產(chǎn)物的質(zhì)譜分析Fig.4 Mass spectrum of target product

2.5 催化劑的選擇

在酯化反應(yīng)中，其核心是催化劑。傳統(tǒng)的濃硫酸催化往往有較多的副產(chǎn)物，分離困難，且會(huì)腐蝕設(shè)備并污染環(huán)境。因此，我們采用DCC/DMAP為催化劑，進(jìn)行 Steglich酯化反應(yīng)［11］，簡易、高效、無污染。該反應(yīng)機(jī)理為:羧酸與 DCC反應(yīng)，生成活性比羧酸更強(qiáng)的O-?；愲?。

酰基異脲受醇進(jìn)攻，產(chǎn)生DCU和相應(yīng)的酯:

反應(yīng)中的O-?；愲蹇砂l(fā)生1，3-重排生成N-酰基脲，從而不能與醇再發(fā)生作用，成為反應(yīng)的副產(chǎn)物。為此需要加入親核性的 DMAP，作為?；D(zhuǎn)移試劑，以減少副反應(yīng)的發(fā)生。

3 結(jié)論

采用DCC/DMAP催化亞油酸和去氧氟尿苷在無水體系中酯化，合成了亞油酸去氧氟尿苷酯。其反應(yīng)條件為:底物摩爾比 n(LA)∶n(FU)=1∶1.2，室溫反應(yīng)18 h。通過核磁共振及質(zhì)譜表征了目標(biāo)產(chǎn)物的組成與結(jié)構(gòu)。

［1］王鳳翼.嬰兒配方乳粉中亞油酸與維生素E的添加量［J］.中國乳品工業(yè)，1987，12(6):258-267.

［2］秦歷杰，劉占舉.轉(zhuǎn)鐵蛋白阿霉素脂質(zhì)體的制備及其對(duì)肝癌細(xì)胞系的殺傷活性［J］.華人消化雜志，2007，15(12):1441-1445.

［3］趙海濤，李寧，桑新亭，等.肝癌靶向治療的研究進(jìn)展［J］.癌癥進(jìn)展雜志，2008，6(3):293-298.

［4］趙子明.亞油酸和聚蘋果酸雙接枝殼聚糖新型納米載體材料及共增強(qiáng)抗腫瘤藥物功效研究［D］.上海:復(fù)旦大學(xué)，2009.

［5］王惠.抗惡性腫瘤新藥——去氧氟尿苷［J］.中國臨床藥學(xué)雜志，1996，5(3):126-127.

［6］王衛(wèi)東.5-氟尿嘧啶類抗癌藥物的分子修飾研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2008，32(12):536-542.

［7］Grem J L.5-Fluorouracil:Forty-plus and still ticking.A review of its preclinical and clinical development［J］.Invest New Drugs，2000，18:299-313.

［8］Nishizawa Y，Casida J E.3’，5’-Diesters of 5-fluoro-2’-deoxyuridine:Synthesis and biological activity［J］.Biochem Pharmacol，1965，14:1605-1609.

［9］Kawaguchi T，Saito M，Suzuki Y，et al.Specificity of esterases and structure of prodrug esters.II.Hydrolytic regeneration behavior of 5-fluoro-2’deoxyuridine(FUdR)from 3’，5’-diesters of FUdR with rat tissue homogenates and plasma in relation to their antitumor activity［J］.Chem Pharm Bull(Tokyo)，1985，33:1652-1659.

［10］Yasuhiro Tsume，John M Hilfinger，Gordon L Amidon.Enhanced cancer cell growth inhibition by dipeptide prodrugs of floxuridine:Increased transporter affinity and metabolic stability［J］.Mol Pharmaceutics，2008，5(5):717-727.

［11］Neises B，Steglich W.Simple method for the esterification of carboxylic acids［J］.Angew Chem Int Ed，1978，17:522-524.