馬令利,戴兆云,張芳,彭子飛
(1.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234;2.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院,上海 200040)
亞油酸(LA)是含有雙鍵的十八碳二烯,作為機(jī)體最重要的必須脂肪酸,亞油酸具有人體維生素地位[1]。它的靶向肝癌作用可能性較大,把具有抗癌活性的化合物結(jié)合上去,可構(gòu)建亞油酸抗癌藥物靶向治療體系。亞油酸作為抗癌藥物靶向的載體,與具有相對(duì)肝癌選擇性的單克隆抗體、某些親肝癌蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)鐵蛋白)[2]、脂質(zhì)體、納米材料、特異胞膜受體抑制劑等其他靶向制劑載體[3]相比,化學(xué)結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單,不易受到破壞,半衰期較長,而且無免疫原性和蛋白抗原性,生物相容性良好,適合面廣等優(yōu)點(diǎn)[4]。因此,亞油酸作為肝癌靶向制劑載體,為腫瘤靶向藥物的創(chuàng)制開拓了新思路。
去氧氟尿苷是5-氟尿嘧啶的衍生物,屬抗代謝類抗腫瘤藥[5]。它作為胸腺嘧啶合成酶等的抑制劑,可抑制腫瘤細(xì)胞DNA的生物合成,體內(nèi)體外均證實(shí)該藥物可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡或凋亡[6-7]。由于其療效確鑿、抗瘤譜廣,所以近50年來,一直是臨床應(yīng)用中高效抗癌藥物,目前已有多種烷基酯的去氧氟脲苷前藥[8-9],并且已經(jīng)證實(shí)對(duì)癌細(xì)胞有很好的選擇性[10]。但去氧氟尿苷熔點(diǎn)高,脂溶性和水溶性都很差,限制了它的實(shí)際應(yīng)用范圍。而去氧氟尿苷的羥基是重要活性基團(tuán),可與脂肪酸形成脂肪酸醇酯,將亞油酸與氟脲苷上戊糖的第5位或第3位游離羥基縮合為酯,合成亞油酸去氧氟尿苷酯的共價(jià)化合物,預(yù)計(jì)該化合物可在有關(guān)酯酶的催化作用下,緩慢釋放氟脲苷,長期抑制腫瘤生長。本文闡述了亞油酸去氧氟尿苷酯的合成方法,并用1H NMR及LCMS表征。
亞油酸(99%);去氧氟脲苷;DMAP、DCC、NaHCO3、飽和食鹽水、無水硫酸鎂、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷均是分析純。
AM-500型核磁共振儀(CDCl3作為溶劑,SiMe4作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn));黃海GF254薄層色譜板;6410B高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。
1.2.1 酯化反應(yīng) 在25 mL圓底燒瓶中加入一定量亞油酸與去氧氟尿苷,使之溶于8 mL干燥后的溶劑二氯甲烷中,形成摩爾比為1∶1.2反應(yīng)底物,并加入等摩爾比DMAP,通入氮?dú)獗Wo(hù),在室溫下磁力攪拌10 min,加入等摩爾比DCC,室溫下反應(yīng)一定時(shí)間后,取樣用于產(chǎn)物分析。
將產(chǎn)物過濾,去除白色沉淀物。濾液進(jìn)行稀釋,過濾掉稀釋后產(chǎn)生的沉淀 DCU。將濾液用飽和NaHCO3水溶液洗滌3次,再用飽和食鹽水洗滌3次,用無水硫酸鎂干燥1 h后過濾。濾液減壓蒸餾除去溶劑得到粘稠狀液體。用二氯甲烷稀釋后作薄層色譜分析。
1.2.2 薄層層析法分析 用點(diǎn)樣毛細(xì)管(0.5 mm)取反應(yīng)稀釋液在預(yù)制的硅膠薄層板上點(diǎn)樣,同時(shí)以去氧氟尿苷、亞油酸兩種原料為對(duì)照,展開劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1,顯色劑為碘蒸氣。
在紫外燈下刮下有產(chǎn)物的硅膠,用二氯甲烷洗出,抽濾,濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去二氯甲烷溶劑,殘留物待測(cè)定。
1.2.3 硅膠柱層析分離產(chǎn)物 硅膠柱層析條件:洗脫劑為 V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1,流速為1滴/s,收集洗脫液,并隨時(shí)用薄層色譜法檢測(cè)產(chǎn)物。收集到的目標(biāo)產(chǎn)物減壓蒸餾,得到粘稠狀液體。
1.3.1 液相部分 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm ×150 mm,5 μm),柱溫 22 ℃;流動(dòng)相為甲醇/水,流動(dòng)相梯度為2 min,甲醇50%;20 min,甲醇95%;流速 0.8 mL/min;進(jìn)樣量 10 μL。
1.3.2 質(zhì)譜部分 干燥氣溫度350℃,干燥氣流量6.0 L/min,霧化器壓力20 psi,毛細(xì)管電壓350 V(+);采集方式為SIM。
通過多次實(shí)驗(yàn),根據(jù)溶劑洗脫順序,選擇了V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1展開劑系統(tǒng),分析結(jié)果見圖1。
圖1 反應(yīng)混合物分析Fig.1 The analysis of mixture
由圖1可知,與原料相比,反應(yīng)液在薄層層析板上部有新的物質(zhì)出現(xiàn),初步判定此物質(zhì)為目標(biāo)產(chǎn)物。不同成分的 Rf值:Rf1=0.15,Rf2=0.40,Rf3=0.72,Rf4=0.83。根據(jù)Rf值可進(jìn)行硅膠柱層析。
將薄層色譜條件轉(zhuǎn)至硅膠柱層析分離。硅膠柱層析分離得到的目標(biāo)產(chǎn)物的TLC分析見圖2。
圖2 目標(biāo)產(chǎn)物分析Fig.2 The analysis of target product
由圖2可知,經(jīng)過硅膠柱分離后,薄層層析板上只有一種新物質(zhì)出現(xiàn)。由此可知,硅膠柱層析分離可以得到較為純凈的目標(biāo)產(chǎn)物。
目標(biāo)產(chǎn)物的1H NMR見圖3。
圖3 目標(biāo)產(chǎn)物的氫譜分析Fig.3 1H NMR of target product
1H NMR(500 MHz,CDCl3,δ):7.41(d,1H,J=6.5 Hz),8.72(s,1H),6.3(t,1H)5.40(m,4H),5.21(d,1H),4.45(q,1H),4.29 ~ 4.17(m,2H),2.82(t,2H),2.35 ~ 2.42(q,2H),2.15 ~ 2.05(m,4H),1.65(m,2H),1.38 ~ 1.27(m,14H),0.91(t,3H)。
目標(biāo)產(chǎn)物的MS分析見圖4。
亞油酸去氧氟尿苷酯的分子量是508.6,由圖4可知,質(zhì)譜圖中出現(xiàn)的509.2峰為[M+H]質(zhì)信號(hào),由此可以斷定,TLC圖中出現(xiàn)的新物質(zhì)為亞油酸去氧氟尿苷酯。
圖4 目標(biāo)產(chǎn)物的質(zhì)譜分析Fig.4 Mass spectrum of target product
在酯化反應(yīng)中,其核心是催化劑。傳統(tǒng)的濃硫酸催化往往有較多的副產(chǎn)物,分離困難,且會(huì)腐蝕設(shè)備并污染環(huán)境。因此,我們采用DCC/DMAP為催化劑,進(jìn)行 Steglich酯化反應(yīng)[11],簡(jiǎn)易、高效、無污染。該反應(yīng)機(jī)理為:羧酸與 DCC反應(yīng),生成活性比羧酸更強(qiáng)的O-?;愲濉?/p>
?;愲迨艽歼M(jìn)攻,產(chǎn)生DCU和相應(yīng)的酯:
反應(yīng)中的O-?;愲蹇砂l(fā)生1,3-重排生成N-?;?,從而不能與醇再發(fā)生作用,成為反應(yīng)的副產(chǎn)物。為此需要加入親核性的 DMAP,作為?;D(zhuǎn)移試劑,以減少副反應(yīng)的發(fā)生。
采用DCC/DMAP催化亞油酸和去氧氟尿苷在無水體系中酯化,合成了亞油酸去氧氟尿苷酯。其反應(yīng)條件為:底物摩爾比 n(LA)∶n(FU)=1∶1.2,室溫反應(yīng)18 h。通過核磁共振及質(zhì)譜表征了目標(biāo)產(chǎn)物的組成與結(jié)構(gòu)。
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