王麗琴，馮 坤，孫 利

(上海市口腔病防治院口腔內(nèi)科，上海 200031)

牙周病是口腔兩大類主要疾病之一，在世界范圍內(nèi)均有較高的患病率。目前，牙周疾病是引起牙周組織缺損最終導(dǎo)致牙齒缺失的最常見(jiàn)病因。因此，對(duì)牙周病病因、發(fā)展以及臨床治療的研究具有相當(dāng)現(xiàn)實(shí)的意義?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是高度保守的依賴于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶家族，可降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì)。MMPs分為5大類:膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解素、膜型MMPs以及結(jié)構(gòu)和功能比較特殊的MMPS?；|(zhì)金屬蛋白酶的主要生理性抑制劑基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMPs)，是一個(gè)低分子量分型蛋白質(zhì)家族，目前已確定了4種TIMPs(TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和 TIMP-4)，每一種都可與MMPs以共價(jià)鍵形式生成1∶1復(fù)合物，對(duì)活化MMPs具有專一的抑制作用。TIMPs對(duì)MMPs活性的抑制作用是MMPs活性的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。

有研究表明，牙周組織細(xì)胞以及炎癥細(xì)胞均可表達(dá)分泌MMPs，MMPs在牙周組織的降解破壞過(guò)程中起著重要的作用。MMP-8屬于膠原酶，是與慢性牙周病有密切關(guān)系的基質(zhì)金屬蛋白酶［1］。本研究旨在探討慢性牙周炎患者和健康人群齦溝液中MMP-8和其抑制劑TIMP-1水平，了解慢性牙周炎患者齦溝液MMP-8以及TIMP-1水平與健康人群的差異和變化。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

30例臨床慢性中、重度牙周炎患者作為病例組。選擇標(biāo)準(zhǔn):無(wú)系統(tǒng)性疾病，近3個(gè)月未使用抗生素及免疫制劑，近3個(gè)月未進(jìn)行牙周藥物及手術(shù)治療。每例患者選取1顆牙周袋探診深度≥4 mm，且頸部無(wú)齲損和充填體的第1或第2磨牙作為觀察對(duì)象。

30例牙周健康者作為對(duì)照組。選擇標(biāo)準(zhǔn):無(wú)系統(tǒng)性疾病，近3個(gè)月未使用抗生素及免疫制劑，近3個(gè)月未進(jìn)行牙周藥物及手術(shù)治療。齦溝深度≤2 mm，齦溝探診不出血，無(wú)明顯牙齦退縮，牙頸部無(wú)齲壞和充填體。每例選取1顆第1或第2磨牙作為觀察對(duì)象。

1.2 材料與儀器

Whatman 3號(hào)濾紙購(gòu)自英國(guó) Whatman公司，Sorvall LengendRT型低溫離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，人 MMP-8、TIMP-1 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biosource公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

GCF采集及定量:將Whatman 3MM濾紙裁成10 mm×2 mm的紙條，隨機(jī)取3條放入有標(biāo)記Ep管中，編號(hào)、電子天平稱重，吹干患牙，隔濕;將預(yù)先稱重的濾紙條放入待檢牙的取液區(qū)(近中、頰面、遠(yuǎn)中，3位點(diǎn)/牙)，放置30 s，稱重，兩次稱重結(jié)果之差即為該牙GCF的重量。樣本置于-70°低溫冰箱中保存。2周內(nèi)在室溫下解凍樣本，每管加入200 μl Tris-HCl液(pH 7.5)，振蕩 1 h，低溫離心 10 min(4℃，離心半徑10 cm，10 000 r/min)，取上清液。樣品采用雙抗體夾心ABC-Elisa法進(jìn)行檢測(cè)，依照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行樣品檢測(cè)。最后通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中MMP-8以及TIMP-1的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)完成。采用兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

數(shù)據(jù)顯示病例組GCF中MMP-8含量高于正常對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。TIMP-1兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MMP-8/TIMP-1比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病例組齦溝液重量高于對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 病例組與對(duì)照組齦溝液MMP-8、TIMP-1濃度以及MMP-8/TIMP-1比值Tab.1 The expression of MMP-8，TIMP-1 and MMP-8/TIMP-1 ratio in GCF of 2 groups

3 討 論

牙周病是細(xì)菌感染性疾病，致病微生物在牙周病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。牙周炎所致的組織破壞主要由宿主的炎癥介質(zhì)介導(dǎo)，這種反應(yīng)包括介導(dǎo)細(xì)胞活性和導(dǎo)致組織破壞的細(xì)胞因子顯著增多［2］。MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要酶類，對(duì)牙周組織的破壞起關(guān)鍵作用。MMPs通過(guò)降解破壞牙周支持組織參與牙周組織附著喪失以及牙槽骨的吸收，在牙周病變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，多種 MMPs在牙周炎癥過(guò)程中發(fā)揮作用。Rathnayake等［3］研究發(fā)現(xiàn)，重癥牙周炎患者唾液中MMP-8的濃度顯著高于正常人群。Marcaccini等［4］也認(rèn)為，慢性牙周炎患者齦溝液MMP-8水平顯著高于正常組。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎患者齦溝液MMP-8水平明顯高于正常對(duì)照組。說(shuō)明牙周炎癥可調(diào)高M(jìn)MP-8的分泌水平，參與牙周炎癥的發(fā)生發(fā)展。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)MMP-8在牙周病的作用尤為重要，研究表明，臨床牙周治療可顯著降低MMP-8的水平，提示MMP-8可作為疾病現(xiàn)狀的判斷指標(biāo)之一，并且可能用于疾病預(yù)后的評(píng)估。MMP-8可能作為一項(xiàng)臨床指標(biāo)，用于牙周病診斷以及監(jiān)測(cè)。M?ntyl?等［5］由此提出椅旁 MMP-8 檢測(cè)方法。由于這種檢測(cè)方法可由牙醫(yī)獨(dú)立操作完成，而不需借助專門的儀器，頗具有實(shí)用性，故GCF中MMP-8的檢測(cè)可能成為診斷和監(jiān)測(cè)牙周病發(fā)展的實(shí)用工具。

本研究發(fā)現(xiàn)病例組TIMP-1水平高于正常對(duì)照組，但二組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。作為MMP-8的抑制劑，TIMP-1廣泛存在于體液和組織液中，其對(duì)MMP-8的抑制作用也是近年來(lái)牙周研究的一個(gè)熱點(diǎn)。一般認(rèn)為，MMPs和TIMPs間的平衡調(diào)節(jié)著細(xì)胞外基質(zhì)的重塑。MMPS/TIMPS的失衡造成組織的吸收。有文獻(xiàn)［6］表明，TIMP-1在健康組織中保持較高水平，在早期炎癥TIMP-1水平較低。而另有文獻(xiàn)則有相反結(jié)論，炎癥過(guò)程中，宿主通過(guò)產(chǎn)生TIMP-1作為抗水解蛋白酶來(lái)對(duì)抗和調(diào)節(jié)MMPs對(duì)組織造成的破壞。所以在炎癥組織中，TIMP-1維持較高 水 平，以 對(duì) 抗 MMPs 對(duì) 組 織 的 破 壞［7-9］。Marcaccini等［10］則認(rèn)為慢性牙周炎患者與正常人群齦溝液中TIMP-1水平無(wú)差異，但兩組間MMP-8/TIMP-1比值有顯著差異，由此推論MMP-8的升高是導(dǎo)致MMP-8/TIMP-1失衡的原因。體外研究發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌可以降解TIMP-1，使TIMP-1失去活性。牙齦卟啉單胞菌可能通過(guò)失活TIMP-1，使得炎癥位點(diǎn)MMPS水平增高，造成牙周組織的損傷［11］。由此可見(jiàn)，MMPs、TIMP-1 與牙周病發(fā)展有著更加復(fù)雜的關(guān)系。MMPs/TIMPs二者的平衡，對(duì)維持牙周健康具有重要作用。

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