王雪婷，羅 明

(同濟大學附屬同濟醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200065)

高血壓通過壓力負荷及一系列神經(jīng)內(nèi)分泌因素，引起心室重構(gòu)，增加心力衰竭的發(fā)生風險，盡管近年來對血壓的控制率有所提高，心室重構(gòu)的高血壓患者發(fā)生心力衰竭事件的仍然較高。粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，GCSF)動員骨髓干細胞，在治療急性心肌梗死、保護心臟、預(yù)防心力衰竭的實驗研究方面取得一定進展［1］，本實驗以自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)為動物模型，通過早期反復(fù)大劑量皮下注射G-CSF動員骨髓干細胞，觀察大鼠心臟功能及病理改變，探討G-CSF對高血壓早期心室重構(gòu)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組用藥

SHR大鼠飼養(yǎng)于海軍醫(yī)學研究所動物房(SPF級)，雄性，體質(zhì)量 250～300 g，每籠 5只，恒溫(24℃ ～25℃)，恒濕(50% ～60%)，自由取食攝水，人工照明，陰暗交替各12 h。

30只SHR大鼠隨機分為3組，每組10只。粒細胞集落刺激因子組(G-CSF組):14 d為1個周期，周期內(nèi)前5 d連續(xù)皮下注射G-CSF(杭州九源基因工程有限公司生產(chǎn))50 μg/(kg·d)，生理鹽水稀釋成0.5 ml，后9 d不用藥物，連續(xù)進行4個周期;假性實驗組(NS組):14 d為1個周期，周期內(nèi)前5 d連續(xù)皮下注射生理鹽水0.5 ml/d，后9 d不用藥物，連續(xù)進行4個周期;空白對照組(空白組)不給藥。每天同一時間(上午9點開始)大鼠皮下注射藥物。實驗干預(yù)期間，每周檢測血壓、體質(zhì)量。血壓采用無創(chuàng)尾套間接測量法，每次測血壓連續(xù)測量3次，取平均值。

1.2 超聲心動圖檢查

8周飼養(yǎng)結(jié)束，將大鼠用3%戊巴比妥鈉以1 ml/kg腹腔注射麻醉，臥位固定，左胸前區(qū)剃毛，用頻率為17.5 Hz探頭對大鼠進行超聲檢查，測量指標包括室間隔厚度(interventricular septal thickness，IVST)、左室舒張末期內(nèi)徑及左室收縮末期內(nèi)徑，左室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)由超聲儀自動計算輸出。各指標均在連續(xù)3個心動周期測量后取其平均值。

1.3 病理學檢查

1.3.1 組織包埋、脫水、切片、染色 取經(jīng)乳頭肌橫斷左室心肌組織，標本編號后放入包埋框沖水3 h，然后將包埋框取出置入包埋機進行垂直石蠟包埋，包埋結(jié)束后將標本轉(zhuǎn)入脫水機進行自動脫水、組織透明及透鈉過程如下:70%乙醇3 h，75%乙醇3 h，80%乙醇3 h，90%乙醇 3 h，95%乙醇 2 h，95%乙醇 2 h，100%乙醇2 h，100%乙醇2 h，二甲苯2 h，二甲苯2 h，石蠟1.5 h，石蠟1.5 h。脫水結(jié)束標本切成3 μm厚玻片標本，每塊組織各制作玻片標本2張，一張行H-E染色，一張行Masson染色。染色后封片。

1.3.2 取材與固定 干預(yù)實驗結(jié)束后，用3%戊巴比妥鈉以1 ml/kg腹腔注射麻醉，解剖大鼠，解剖過程注意觀察胸腹各臟器外觀有無異常。迅速摘取心臟，去除心房、大血管和心包組織，留取心室，冰生理鹽水沖洗干凈，清潔濾紙吸干水分用電子天平稱心室濕重，組織用4%多聚甲醛溶液固定。

1.3.3 圖像分析 圖像于光學顯微鏡下觀察拍照，照片采用計算機輔助圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus 6.0進行分析。在H-E染色下，觀察左心室心肌的基本病理變化。在Masson染色下左心室心肌標本測定心肌膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)和血管周圍膠原面積(perivascular collagen area，PVCA)。切片上隨機選取10個視野，通過灰度調(diào)節(jié)區(qū)別膠原和非膠原成分，膠原容積分數(shù)為膠原面積與心肌面積的比值，取平均值，其中膠原面積不包括血管周圍膠原面積。血管周圍膠原面積為每一個標本測量5支呈橫切面壁內(nèi)小動脈的周圍膠原面積與血管腔面積的比值，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學處理

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包分析，實驗結(jié)果以x±s表示。3組統(tǒng)計采用單因素方差分析(ANOVA，LSD)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 體質(zhì)量及血壓指標

干預(yù)前各組SHR大鼠體質(zhì)量、收縮壓及舒張壓指標差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.5)。8周干預(yù)后各組SHR大鼠體質(zhì)量、收縮壓及舒張壓指標差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.5)，見表1。

表1 干預(yù)前、后各組體質(zhì)量、收縮壓、舒張壓比較Tab.1 Comparison of body weight，systolic blood pressure，diastolic blood pressure before and after intervention(±s)

1 mmHg=0.133 kPa

BW/g SBP/mmHg DBP/mmHg組別干預(yù)前 干預(yù)后 干預(yù)前 干預(yù)后 干預(yù)前 干預(yù)后G-CSF組 282±13 377±10 186±4 198±5 144±5 153±4 NS組 282±11 384±12 184±6 200±5 142±4 154±5空白組279±11 383±14 185±6 199±6 141±3 155±5

2.2 心室質(zhì)量/體質(zhì)量、心超室間隔厚度、左室短軸縮短率比較

實驗干預(yù)8周后，解剖結(jié)果顯示，G-CSF組較NS組及空白組心室質(zhì)量/體質(zhì)量比值(VW/BW)增加差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);心臟彩超顯示GCSF組較NS組及空白組IVST增加(P＜0.05)，F(xiàn)S增加(P＜0.05)，提示G-CSF促進自發(fā)性高血壓大鼠心室肥厚，增強心肌收縮力，維持心臟功能。NS組與空白組相比，VW/BW、IVST、FS差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，提示生理鹽水皮下注射刺激對大鼠心室結(jié)構(gòu)改變及功能無明顯影響，見表2。

表2 心室質(zhì)量/體質(zhì)量比值、心超室間隔厚度、左室短軸縮短率Tab.2 Ventricular weight/body weight，interventricular septal thickness，fractional shortening in 3 groups(±s)

表2 心室質(zhì)量/體質(zhì)量比值、心超室間隔厚度、左室短軸縮短率Tab.2 Ventricular weight/body weight，interventricular septal thickness，fractional shortening in 3 groups(±s)

與 G-CSF 組相比，(1)P ＜0.05，(2)P ＜0.01

組別 (VW/BW)/‰ IVST/mm FS G-CSF 組 4.34 ±0.16 3.01 ±0.10 61.86 ±5.63 NS 組 4.06 ±0.18(2) 2.88 ±0.11(1) 49.16 ±5.32(2)空白組 4.10 ±0.20(2) 2.84 ±0.13(1) 49.51 ±5.23(2)

2.3 H-E 染色

心肌組織的H-E染色顯示，G-CSF組心肌纖維較NS組及空白組致密，排列相對整齊;NS組與空白對照組較為接近，心肌纖維排列紊亂，部分甚至斷裂，見圖1。此結(jié)果與解剖及心超結(jié)果一致，提示GCSF促進自發(fā)性高血壓大鼠心肌良性肥厚，對抗后負荷。

圖1 大鼠心肌H-E染色Fig.1 Rat myocardial H-E staining(×100)

2.4 Masson 染色

光鏡下可見心肌細胞核呈藍褐色，胞漿呈紅色，膠原纖維呈藍色。NS組及空白組SHR心肌細胞間及血管壁周圍可見大量膠原纖維增生，較G-CSF組明顯增加，見圖2。NS組與空白組間心肌CVF和PVCA差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，G-CSF組與另2組相比CVF、PVCA明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3。提示G-CSF改善心肌纖維化。

圖2 大鼠心肌Masson染色Fig.2 Rat myocardial Masson staining(×100)

表3 心肌CVF和PVCA變化Tab.3 Changes of collagen volume fraction and perivascular collagen area (±s)

表3 心肌CVF和PVCA變化Tab.3 Changes of collagen volume fraction and perivascular collagen area (±s)

與對照組相比，(1)P ＜0.01

組別 例數(shù)CVF/% PVCA/%G-CSF 組 10 4.82 ±0.55(1) 0.85 ±0.12(1)NS 組 10 6.26 ±0.54 1.17 ±0.10空白組 10 6.12 ±0.53 1.14 ±0.15

3 討 論

3.1 改善高血壓左室及血管重構(gòu)的意義

心臟重構(gòu)是高血壓最重要的靶器官損害，心臟的重構(gòu)主要表現(xiàn)為心肌肥厚缺血缺氧與心肌間質(zhì)纖維化，而心肌間質(zhì)纖維化在心力衰竭的發(fā)生過程中更為重要，歐洲高血壓協(xié)會(European Society of Hypertension，ESH)指南中指出，高血壓患者心血管系統(tǒng)總體風險評估，不僅取決于血壓水平，還取決于是否存在臨床或亞臨床靶器官損害，亞臨床靶器官損害是高血壓患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子［2］。對高血壓導致的靶器官損害進行早期診斷，有針對性地盡早治療，逆轉(zhuǎn)或延緩損傷，具有決定性意義。

3.2 高血壓心血管重構(gòu)的機制

高血壓通過影響機體內(nèi)皮功能、腎素血管緊張素系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)、細胞內(nèi)鈣超載等，造成心血管重構(gòu)［3］，血壓的升高是高血壓心血管重構(gòu)的始動因素，由于后負荷的增加，心肌代償肥大，以滿足周圍循環(huán)的灌注，但是肥大的心肌克服阻力做功較多，相對容易缺血缺氧，心肌細胞往往排列紊亂，而原發(fā)性高血壓本身內(nèi)皮功能受損，細胞凋亡加速，心肌及周圍毛細血管減少，肥厚的心肌更加缺血缺氧，乳酸堆積，由于毛細血管的減少，不利于心肌代謝不良產(chǎn)物排出，加之高血壓神經(jīng)體液內(nèi)環(huán)境的紊亂，心肌周圍膠原更容易發(fā)生纖維化，造成室壁運動僵硬，順應(yīng)性減低，心臟收縮力減弱，以致周圍灌注不足，而循環(huán)灌注的損傷更加重了內(nèi)環(huán)境的失調(diào)，在持續(xù)的后負荷作用下，缺血缺氧且活動度差的心肌排列更加紊亂，甚至出現(xiàn)斷裂，失代償?shù)男氖冶诜票?，呈現(xiàn)心力衰竭。

3.3 G-CSF調(diào)節(jié)高血壓心血管重構(gòu)的機制

G-CSF通過心肌表面受體G-CSFR發(fā)揮直接保護作用，抑制心肌缺血再灌注損傷［4］，G-CSF還可通過干擾SDF-1與其受體CXCR4結(jié)合，動員骨髓干細胞致外周血，G-CSF動員的CD34+細胞包含未成熟及成熟的內(nèi)皮及心肌先祖細胞，體外培養(yǎng)證實可分化為內(nèi)皮細胞及心肌細胞，動物和臨床實驗直接輸入心肌，可參與心肌損傷再生修復(fù)，減弱梗死導致的電傳導減慢，減小梗死瘢痕面積，提高梗死區(qū)周圍灌注，增加毛細血管密度，增加梗死區(qū)心室壁厚度，阻止膠原沉積，保留心室?guī)缀谓Y(jié)構(gòu)，減弱電生理重構(gòu)，減少心律失常發(fā)生可能，提高左室射血分數(shù)，延緩心衰［5］。

3.4 G-CSF調(diào)控高血壓心血管重構(gòu)的有效性

在大量心肌梗死動物模型中已經(jīng)證實，連續(xù)5 d皮下注射G-CSF 50 g/(kg·d)可有效動員大鼠骨髓干細胞，促進毛細血管生成，減少心肌纖維化，改善心臟射血分數(shù)及遠期預(yù)后，本實驗將G-CSF在心肌梗死過程中表現(xiàn)出的保護作用，轉(zhuǎn)化至高血壓模型中觀察，由于高血壓心血管重構(gòu)自然病程較長，進展緩慢，考慮一次或短期的用藥可能不足以產(chǎn)生有益效果，且G-CSF對于SDF-1/CXCR4信號軸的激活以動員骨髓干細胞，在開始用藥后14 d達到峰值，21 d時作用已經(jīng)明顯減弱［6］，本實驗創(chuàng)新性設(shè)計通過8周內(nèi)連續(xù)4個周期，每個周期前5 d連續(xù)50 g/(kg·d)皮下注射G-CSF，反復(fù)動員骨髓干細胞?？紤]等已進展至心力衰竭再應(yīng)用G-CSF，收益可能減小，本實驗選取10周齡SHR大鼠，在心血管重構(gòu)早期反復(fù)給予大劑量G-CSF動員骨髓干細胞，以觀察其對自發(fā)性高血壓大鼠心血管重構(gòu)的作用。

實驗結(jié)果顯示，應(yīng)用G-CSF大鼠心臟較對照組肥厚，左室短軸收縮率提高，心肌收縮力增強，心臟纖維化減少。與傳統(tǒng)意義上改善心臟重構(gòu)理解不同的是，G-CSF不是減輕心臟肥厚，而是增加了心室質(zhì)量/體質(zhì)量比值及室間隔厚度，眾所周知高血壓心室肥厚是預(yù)后的不良因素，分析肥厚的心肌造成預(yù)后不良的原因，是由于肥厚的心肌缺血缺氧，加之心肌間質(zhì)纖維化的束縛，順應(yīng)性下降，容易發(fā)生失代償進而心力衰竭，而如前所述G-CSF動員骨髓干細胞可增加心肌修復(fù)，促進毛細血管生成，改善供血，并且減少纖維化，而纖維化才是造成室壁活動僵硬舒張減退的更重要的引起心力衰竭的因子，因此可以理解為自發(fā)性高血壓大鼠接受G-CSF動員骨髓干細胞后，心肌在壓力負荷下代償性良性增生肥厚，且結(jié)合病理學結(jié)果，G-CSF組心肌細胞排列較整齊，而NS組及對照組心肌排列紊亂，甚至部分出現(xiàn)斷裂，更進一步的心超結(jié)果也證實了G-CSF組肥厚心肌功能較對照組好，左室短軸收縮率提高，心肌收縮力增強，與大樣本高血壓患者橫斷面研究中顯示高血壓肥厚性重構(gòu)與收縮及舒張功能減退及心室內(nèi)壓力增高相關(guān)不同［7］，G-CSF組并沒有表現(xiàn)出疾病過度進展出現(xiàn)的肥厚心肌運動力差、收縮及舒張功能減退的情況，而心肌收縮及舒張功能的減退，必然導致周圍灌注不足，加重內(nèi)環(huán)境的紊亂，反過來加重心衰。

心臟在壓力、容量負荷及損傷等情況下，為維持心臟功能，代償出現(xiàn)適應(yīng)性肥厚，生理性肥厚表現(xiàn)為正常的心臟形態(tài)與加強的心臟功能，而病理性肥厚表現(xiàn)為間質(zhì)纖維化、細胞死亡的增多及心臟功能的喪失［8］。與運動體育訓練出現(xiàn)的心臟肥厚相似，GCSF介導的心肌肥厚，沒有證據(jù)提示加速疾病進展，且伴隨心肌毛細血管增加，血供改善，心肌收縮力增強，心臟纖維化減少，室壁活動度改善，潛在改善舒張功能，是適應(yīng)性良性肥厚，這種肥厚能否成為一種額外儲備延緩遠期心力衰竭尚待進一步研究。此外，由于血壓的升高才是心臟及血管重構(gòu)纖維化的始動因素，本實驗對血壓并未控制，采取自然狀態(tài)，可以推測，良好的控制血壓條件下，心肌不需要克服巨大的后負荷阻力，早期反復(fù)大劑量G-CSF誘導骨髓干細胞對于心臟的保護作用，可能存在更良好的受益。

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