王海鷹,賈樂華,吳仁人,王菊芳,寧正祥

(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州510006；2.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所,廣東 廣州510640；3.廣東省水與大氣污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州510640；4.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東 廣州510006)

特異性擬桿菌引物在珠江三角洲的適應(yīng)性研究

王海鷹1,賈樂華1,吳仁人2,3*,王菊芳1,寧正祥4

(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州510006；2.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所,廣東 廣州510640；3.廣東省水與大氣污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州510640；4.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東 廣州510006)

在珠江三角洲地區(qū)采集人、豬、牛、狗以及家禽等33個(gè)糞便樣品,高效提取基因組DNA,選取14種特異性擬桿菌引物進(jìn)行檢驗(yàn)分析,并進(jìn)一步采用已知污染源類型的水樣對其進(jìn)行驗(yàn)證.結(jié)果表明:采用糞便樣品DNA專屬提取試劑盒和水體樣品DNA專屬提取試劑盒提取的基因組模版純度和提取率均符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求.擬桿菌通用引物2#(Bac32F/Bac708R)檢出率為85%(28/33),特別是對哺乳類動物和雞的糞便具有更高的檢出率.人的擬桿菌特異性引物3#(HF134F/ Bac708R)和4#(HF183F/Bac708R)、反芻動物的擬桿菌特異性引物8#(CF128F/Bac708R)以及豬的擬桿菌特異性引物10#(PF163F/Bac708R)在珠江三角洲地區(qū)同時(shí)具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的特異性.水體樣品驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與實(shí)際污染類型相符,說明擬桿菌通用引物2#、人的特異性引物3#和4#以及豬的特異性引物10#在珠江三角洲地區(qū)具有很好的適用性.

擬桿菌；特異性引物；靈敏度；特異性；珠江三角洲地區(qū)

隨著我國畜禽養(yǎng)殖的發(fā)展及規(guī)模的擴(kuò)大,糞便產(chǎn)生量的不斷增加,畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來的生態(tài)環(huán)境問題也變得日益突出[1].未經(jīng)處理(或未完全處理)的糞便隨徑流進(jìn)入地表水,造成環(huán)境水體中微生物污染較為普遍[2].由于缺乏糞便污染來源的準(zhǔn)確信息使得目前治理仍停留在見污治污階段,極大增加了污染治理的難度與成本.近年來,歐美等發(fā)達(dá)國家紛紛開展了以宿主特異性生物標(biāo)記為基礎(chǔ)的水體微生物污染源解析的研究工作,并已開發(fā)出了豬[3]、牛[4-5]、人[6-8]、雞[9]、野禽[10-11]等動物的多種特異性引物.

然而,宿主消化道內(nèi)各種腸道菌群之間的相互作用極為復(fù)雜,并且外界環(huán)境的差異性易導(dǎo)致消化道內(nèi)菌群的基因發(fā)生變化,造成不同地區(qū)特異性基因表達(dá)差異的現(xiàn)象較為普遍,如Okabe等[12]針對豬體設(shè)計(jì)的引物Bac41F/PS183R 在日本的札幌和江別市進(jìn)行檢測時(shí)具有很好的特異性,而 Mieszkin等[13]在法國驗(yàn)證的結(jié)果表明該引物雖然在豬的糞便樣品中可完全得到擴(kuò)增,但在其他某些動物的糞便樣品中也有陽性結(jié)果產(chǎn)生.

目前,部分已開發(fā)出的宿主特異性引物在當(dāng)?shù)匾延泻芎玫尿?yàn)證,但其特異性在我國尚不明確,因此應(yīng)積極開展地域適應(yīng)性的生物標(biāo)記研究.本研究提取珠江三角洲地區(qū)人和多種動物糞便樣品的 DNA,選取不同的特異性引物對宿主 DNA進(jìn)行驗(yàn)證,并進(jìn)一步采用已知污染來源的水樣驗(yàn)證,以探尋其地域適應(yīng)性,為珠江三角洲地區(qū)水域糞便污染來源分析提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器:PCR 儀(ALD1234, ALS1296, Bio-Rad公司),冷凍離心機(jī)(5804R,Thermo公司),凝膠成像儀(212PRO,GelLogic公司)

主要試劑:糞便基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司),omega Water DNA Kit (OMEGA Bio-Tek D5525-01),PCR kit(2× Reaction Mix,Taq DNA聚合酶,廣州東盛生物科技有限公司),蛋白酶 K(天根生化科技有限公司),DNA marker(Takara),瓊脂糖(Biowest,電泳級).

1.2 樣本采集

1.2.1 糞便樣品 2013年4～5月在廣東境內(nèi)東江和北江流域的多個(gè)畜禽養(yǎng)殖場采集家禽、家畜、狗等生物糞便樣品,在醫(yī)院的配合下采集廣州地區(qū)人的糞便樣品.糞便樣品數(shù)共計(jì)33份,其中:廣州市蘿崗區(qū)13份、廣州市白云區(qū)9份、廣州市越秀區(qū)5份、廣東省清遠(yuǎn)市1份、廣東省惠州市5份;雞9份、豬8份、牛6份、人5份、鴨2份、狗1份、鵝1份、鴿1份.所有樣品編號,保存于冰盒中,在6h內(nèi)運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.2 水體樣品 對已知造成糞便污染的水體進(jìn)行樣品采集.其中廣州市污水處理廠A和B進(jìn)水口水樣各1份、以及惠州某生豬養(yǎng)殖場旁水塘水樣1份.樣品編號,保存于冰盒中,在6h內(nèi)運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.3 DNA提取

糞便樣本基因組 DNA提取:采用糞便基因組DNA提取試劑盒通過懸浮、破碎、吸附柱純化等步驟從糞便樣品中提取基因組DNA,具體步驟按照說明書進(jìn)行.

水體樣本基因組DNA提取:用0.22μm微孔濾膜過濾水樣,將濾膜剪碎置于50mL離心管中,按照omega Water DNA Kit的說明,提取水體中的DNA.DNA 樣品于-20℃保存?zhèn)溆?

1.4 PCR擴(kuò)增

擬桿菌通用引物及人和不同動物擬桿菌引物見表1. PCR反應(yīng)體系20μL:2×Reaction Mix10μL,Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.4μL,10μmol/L上下游引物各0.8μL,DNA模板(5ng/μL)0.4μL,滅菌超純水7.6μL; PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3min,94℃變性30s,53～62℃退火30s(不同引物退火溫度具體見表1),72℃延伸90s,重復(fù)30個(gè)循環(huán),72℃延伸10min; PCR結(jié)果檢測:以2000bp DNA marker為標(biāo)準(zhǔn),PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳.

1.5 數(shù)據(jù)分析

靈敏度(r)和特異性(s)分析采用以下公式計(jì)算:r＝[TP/(TP＋FN)] ,s＝[TN/(TN＋FP)][14].其中:TP表示PCR引物對自己種屬的樣品進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)的陽性樣本數(shù)(真陽性),FN表示PCR引物對自己種屬的樣本進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)的陰性樣本數(shù)(假陰性);TN表示PCR引物對其他種屬的樣品進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)的陰性樣本數(shù)(真陰性),FP表示PCR引物對其他種屬的樣品進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)的陽性樣本數(shù)(假陽性).

表1 不同宿主的擬桿菌特異性生物標(biāo)記引物Table1 Host-specific primers of Bacteroidales from selected species

2 結(jié)果與討論

2.1 基因組DNA提取

采用試劑盒抽提的糞便基因組DNA和水樣基因組DNA的濃度、提取率以及A260/A280的比值如表2所示.在電泳圖中這些條帶明亮且單一,可以用于后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn).本研究使用的專屬糞便基因組DNA和水樣基因組DNA提取試劑盒中的離心吸附柱能高效、專一吸附DNA,最大限度地去除雜質(zhì)蛋白及其他有機(jī)化合物.將 CTAB法以及試劑盒提取方法得到的基因組DNA進(jìn)行了對比,發(fā)現(xiàn)采用試劑盒抽提方法得到的基因組純度和提取率均符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求,并且在對大量樣本進(jìn)行抽提時(shí)具有效率高,穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn).

2.2 糞便樣品對特異性生物標(biāo)記引物的驗(yàn)證

以得到的糞便樣品基因組 DNA為模板,選取已有擬桿菌通用引物,人的擬桿菌引物,反芻動物擬桿菌引物以及豬的擬桿菌引物,分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,每一對引物擴(kuò)增得到的陽性樣本數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果以及靈敏度和特異性分析分別見表3和表4.

采用擬桿菌通用引物(1#、2#)對33個(gè)糞便樣品(人、豬、牛以及家禽等)和1個(gè)作為陰性對照的大腸桿菌樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,陽性樣本分別為15和28個(gè).如表3中統(tǒng)計(jì)所示,鴨、鵝、鴿樣品在用擬桿菌通用引物、人的擬桿菌引物、豬的擬桿菌引物、反芻動物擬桿菌引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增時(shí),均為陰性.這與之前的文獻(xiàn)中指出禽類和鳥類與人、豬、牛、羊等哺乳動物糞便中的優(yōu)勢菌群存在差異的報(bào)道一致.總體而言,擬桿菌為人、豬、牛、羊等哺乳動物糞便中的優(yōu)勢菌群[21],而禽類和鳥類與之有較大差異.如Lu等[9]在雞的糞便中提取了471個(gè)基因序列,多樣性結(jié)果顯示微生物分屬19個(gè)不同的菌屬,主要有梭狀芽孢桿菌(20.9%)、芽孢桿菌(17.3%)和擬桿菌(15.0%),在野鵝糞便中芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌為優(yōu)勢菌屬[10].對比可知,2#引物在以擬桿菌為優(yōu)勢菌群的哺乳類動物糞便中具有更高的檢出率,對雞糞便中擬桿菌也有很好的識別.

表2 糞便樣品和水體樣品基因組DNA濃度,A260/A280值以及提取率Table2 Absorbance ratio of260/280nm, concentration and extraction rate of genome DNA of fecal and water samples

為了考察各類已開發(fā)的特異性引物的地區(qū)適應(yīng)性,采集生物糞便樣品分別進(jìn)行驗(yàn)證.采用人的特異性引物(3#～7#)分別對所采集的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,除3#外其它引物對人類糞便均有100%靈敏度.但5#和6#引物除了對人類糞便外,對豬、牛、雞等動物糞便也具有假陽性響應(yīng),而4#和7#引物的特異性較好(分別為96%和93%).當(dāng)采用反芻動物特異性引物對牛糞便樣本進(jìn)行PCR檢測時(shí),8#引物的靈敏度和特異性均為100%.而9#引物分別為67%和41%,不適合于目標(biāo)研究區(qū)域使用.豬的特異性引物(10#～14#)靈敏度都比較高,只有11#引物在所檢測的6個(gè)樣本中陽性結(jié)果為83%,其他引物均能全部擴(kuò)增得到目標(biāo)產(chǎn)物.在靈敏度相對較高的4對引物中,10#和14#引物的特異性最好,分別為92%和95%,但引物14在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)得到的目標(biāo)條帶較引物10弱.綜合以上結(jié)果可知,擬桿菌通用引物2#(Bac32F/ Bac708R)、人的特異性引物3#(HF134F/ Bac708R)和引物4#(HF183F/Bac708R)、反芻動物特異性引物8#(CF128F/Bac708R)以及豬的特異性引物10#(PF163F/Bac708R)同時(shí)具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的特異性,在目標(biāo)研究區(qū)域具有很好的適應(yīng)性.同時(shí),由于鵝、鴿、狗等動物不是珠江三角洲地區(qū)常見養(yǎng)殖品種,以致只采集到有限數(shù)量的樣本,本研究所采用的生物標(biāo)記引物對其特異性有待進(jìn)一步加強(qiáng)驗(yàn)證.

擬桿菌近年來被廣泛應(yīng)用在水體微生物源解析領(lǐng)域.與大腸桿菌相比,擬桿菌在哺乳動物糞便的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于大腸桿菌,在水體中有較長的存在時(shí)間,同時(shí)擬桿菌中的一些特異性的分子標(biāo)記比大腸桿菌的檢測更為靈敏,具有更好的宿主特異性.但由于宿主消化道內(nèi)各種腸道菌群之間的相互作用極為復(fù)雜,并且外界環(huán)境的差異性易導(dǎo)致消化道內(nèi)菌群的基因發(fā)生變化,因此特異性引物存在較明顯的地區(qū)差異性.如對加拿大安大略省和美國俄亥俄州野鵝糞便的生物多樣性比對發(fā)現(xiàn),前者芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌兩種優(yōu)勢菌分別占46.3%和38.4%,而后者則分別為30.2%和28.9%[10].在特異性基因表達(dá)方面,因地區(qū)差異造成特異性基因表達(dá)不同的現(xiàn)象更為普遍.如 Okabe 等[12]針對豬體設(shè)計(jì)的引物Bac41F/ PS183R(12#)在日本的札幌和江別市進(jìn)行檢測時(shí)具有很好的特異性,而Mieszkin 等[13]在法國布列塔尼地區(qū)驗(yàn)證的結(jié)果表明該引物雖然在豬的糞便樣品中可完全得到擴(kuò)增,但是在其他物種的一些樣品中也有陽性結(jié)果產(chǎn)生.本研究中,該引物在部分人類、牛和雞的糞便中可被擴(kuò)增,也證明其地域差異性,不適合在珠江三角洲地區(qū)使用.此外,Bernhard等[17]設(shè)計(jì)了人的2種特異性引物 HF134F/ Bac708R(3#)和HF183F /Bac708R(4#),驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)3#引物與其他的動物之間沒有發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng),且在人的糞便樣品中普遍存在,同時(shí)具有較好的敏感性和特異性,4#引物只在不到一半的人糞便樣品中有特異性擴(kuò)增.而在珠江三角洲地區(qū)的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),3#引物雖然有很好的特異性,但靈敏度僅為80%.但4#引物在目標(biāo)研究區(qū)域中對所檢測的5個(gè)人糞便樣品有全部陽性響應(yīng),其它30個(gè)非人糞便樣品中,僅有一個(gè)假陽性響應(yīng).可見4#引物適合在珠江三角洲地區(qū)推廣使用.

2.3 已知污染源水樣對特異性生物標(biāo)記引物的驗(yàn)證

表3 擬桿菌引物PCR陽性結(jié)果Table3 Positive results obtained with Bacteroidales biomarkers

表4 擬桿菌引物靈敏度與特異性分析Table4 Sensitivity and specificity of the Bacteroidales biomarkers analyzed

擬桿菌是常寄居哺乳動物體內(nèi)的一類革蘭氏陰性、無芽孢、專性厭氧的細(xì)菌[22],其在有氧條件下存活的狀態(tài)不盡相同,大部分?jǐn)M桿菌在有氧環(huán)境中只能存活幾個(gè)小時(shí).但仍有擬桿菌的DNA 在水體中存在數(shù)天乃至數(shù)周仍然可以被檢測到,為其在微生物溯源中的應(yīng)用提供了可能[23].而目前不同擬桿菌生物標(biāo)記進(jìn)入環(huán)境中的存在時(shí)間和遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律尚不明確.因此,采用上述實(shí)驗(yàn)中靈敏度和特異性均較好的引物(擬桿菌通用引物2#、人特異性引物3#和引物4#、反芻動物特異性引物8#、豬特異性引物10#)分別對廣州市污水處理廠A和B(生活污水)進(jìn)水口、以及惠州某生豬養(yǎng)殖場旁水塘等已知污染源類型的水樣進(jìn)行分析檢驗(yàn),結(jié)果如圖1～圖3所示.

圖1 A水處理廠進(jìn)水口水樣PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Water genome DNA from water treatment company A amplified with host-specific different Bacteroidales primers

圖2 B污水處理廠進(jìn)水口水樣PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Water genome DNA from water treatment company B amplified with host-specific different Bacteroidales primers

圖3 惠州農(nóng)村豬舍旁水塘水樣PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Water genome DNA from the pool next to the hoggery of Huizhou amplified with host-specific different Bacteroidales primers

當(dāng)采用擬桿菌通用引物2#(Bac32F/Bac708R)對上述水樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),所有樣品均有目標(biāo)條帶的擴(kuò)增(條帶2),推測水樣受到糞便污染.采用人的特異性引物3#(HF134F/Bac708R)和4#(HF183F/Bac708R)對水樣進(jìn)行擴(kuò)增時(shí),兩個(gè)生活污水處理廠進(jìn)水口的水樣均得到了目標(biāo)條帶(條帶3和4),豬舍旁水塘的水樣未有目標(biāo)條帶,表明市政污水中有人類糞便的排放,但豬舍旁水塘未受受到人類糞便污染.當(dāng)上述水樣都采用反芻動物特異性引物8#(CF128F/Bac708R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),均未得到目標(biāo)條帶,說明市政污水和豬舍旁水塘的水體并沒有受到牛、羊等反芻動物糞便的污染.以上說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與事情情況完全相符.采用豬的特異性引物10#(PF163F/Bac708R)對水樣進(jìn)行 PCR擴(kuò)增時(shí),豬舍旁水塘的水 PCR結(jié)果為陽性,而生活污水處理廠進(jìn)水口的水PCR結(jié)果也為陽性,只在采用相同的模板量進(jìn)行擴(kuò)增時(shí),生活污水處理廠進(jìn)水口的水?dāng)U增條帶稍微弱一些,但是因?yàn)闆]有采用定量PCR,所以不能嚴(yán)格區(qū)分這兩者的差別.實(shí)驗(yàn)室自來水采用上述5對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),結(jié)果都為陰性(圖4).

目前,擬桿菌常作為特異性生物標(biāo)記用來檢測水體中糞便污染來源.本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已有的擬桿菌通用引物、人、反芻動物以及豬的擬桿菌引物,對珠江三角洲地區(qū)采集的糞便樣品進(jìn)行驗(yàn)證,得到多個(gè)適合目標(biāo)研究區(qū)域且靈敏度較高和特異性較好的引物,并初步在已知污染來源的水樣中得到驗(yàn)證.在本實(shí)驗(yàn)中,由于客觀條件的限制,分析的糞便樣本以及已知污染來源的水樣樣本數(shù)相對較少,需要進(jìn)一步進(jìn)行大量樣本的驗(yàn)證,為珠江三角洲地區(qū)水體環(huán)境提供可靠的糞便污染來源分析.此外,由于自然環(huán)境和社會發(fā)展水平等因素的差異,歐美與我國在微生物源解析研究的關(guān)注點(diǎn)上有較大不同.比如美國農(nóng)場牛的存欄數(shù)為8930萬頭(截至2013年1月1日),每年牛糞產(chǎn)生量約10億t[24],為畜禽廢棄物的最大來源.愛爾蘭每年畜禽養(yǎng)糞便產(chǎn)生量約為1億t,其中牛和羊的產(chǎn)生量占總量的96%[25].而我國畜禽養(yǎng)殖主要以豬和禽類為主,以廣東為例,豬和雞糞便的年產(chǎn)生量約占總量的63%,牛糞只占約17%,與歐美的社會情況相比有著非常明顯的差異.歐美等國在對反芻動物和的微生物多樣性[26]、源解析[27]和病源微生物[28]等方面有較多研究,但對豬和家禽類的關(guān)注相對較少.因此,需針對我國特色加強(qiáng)種類單一、地區(qū)適應(yīng)性不好的特異性引物設(shè)計(jì)和開發(fā)工作.

圖4 實(shí)驗(yàn)室自來水水樣PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Tap water genome DNA of the lab amplified with host-specific different Bacteroidales primers.

3 結(jié)論

3.1 擬桿菌為哺乳類動物糞便的優(yōu)勢菌群,因此具有更高的檢出率.

3.2 識別出人的特異性引物 4#(HF183F/ Bac708R)、反芻動物特異性引物8#(CF128F/ Bac708R)以及豬的特異性引物10#(PF163F/ Bac708R)在珠江三角洲地區(qū)同時(shí)具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的特異性.

3.3 水體樣品驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與實(shí)際污染類型相符,說明擬桿菌通用引物2#(Bac32F/Bac708R)、人的特 異 性 引 物 3#(HF134F/ Bac708R)、4#(HF183F/Bac708R)和 豬 的 特 異 性 引 物10#(PF163F/Bac708R)在珠江三角洲地區(qū)具有很好的適用性.

[1] 仇煥廣,井 月,廖紹攀,等.我國畜禽污染現(xiàn)狀與治理政策的有效性分析 [J]. 中國環(huán)境科學(xué),2013,33(12):2268-2273.

[2] Gagliaedi J V, Karns J S. Leaching of Escherichia coli O157:H7in diverse soils under various agricultural management practices [J]. Appl. Environ. Microbiol,2000,66:877-886.

[3] Mieszkin S, Furet J, Corthier G, et al. Estimation of pig fecal contamination in a river catchment by real-time PCR using two pig-specific Bacteroidales16S rRNA genetic markers [J]. Appl. Environ. Microbiol,2009,75(10):3045-3054.

[4] Ahmed W, Powell D, Goonetilleke A, et al. Detection and source identification of faecal pollution in non-sewered catchment by means of host-specific molecular markers [J]. Water Sci. Tech.,2008,58(3):579-586.

[5] Sionbhan D R, Justin O G, Emer C. Specificity and sensitivity evaluation of novel and existing Bacteroidales and Bifidobacteria-specific PCR assays on feces and sewage samples and their application for microbial source tracking in Ireland [J]. Water Res.,2009,43(19):4980-4988.

[6] Gawler A H, Beecher J E, Brandao J, et al. Validation of host-specific Bacteriodales16S rRNA genes as markers to determine the origin of fecal pollution in Atlantic Rim countries of the European Union [J]. Water Res.,2007,41:3780-3784.

[7] Ahmed W, Stewart D P, Gardner T, et al. Evaluation of Bacteroides markers for the detection of human faecal pollution [J]. Appl. Microbiol.,2008,46:237-242.

[8] Shanks O C, Santo Domingo J W, Lu J. Identification of bacterial DNA markers for the detection of human fecal pollution in water[J]. Appl. Environ. Microbiol.,2007,73:2416-2422.

[9] Lu J, Santo Domingo J W, Shanks O C. Identification of chicken specific fecal microbial sequences using a metagenomic approach [J]. Water Res.,2007,41:3561-3574.

[10] Lu J, Santo Domingo J W, Hill S, et al. Microbial diversity and host-specific sequences of Canada goose feces [J]. Appl. Environ. Microbiol.,2009,75:5919-5926.

[11] Ryu H, Lu J, Vogel J, et al. Development and evaluation of a quantitative PCR assay targeting sandhill crane (Grus canadensis) fecal pollution [J]. Appl. Environ. Microbiol.,2012,78:4338-4345.

[12] Okabe S, Okayama N, Savichtcheva O, et al. Qantification of host-specific Bacteroides-Prevotella16S rRNA genetic markers for assessment of fecal pollution in freshwater [J]. Appl. Microbiol. Biotech.,2007,74(4):890-901.

[13] Mieszkin S, Furet J P, Corthier G, et al. Estimation of pig fecal contamination in a river catchment by Real-Time PCR using two pig-specific Bacteroidales16S rRNA genetic markers [J]. Appl. Environ. Microbiol.,2009,75:3045-3054.

[14] Elisenda Ballesté, Xavier Bonjoch, Lluís A. Belanche, et al. Molecular Indicators Used in the Development of Predictive Models for Microbial Source Tracking [J]. Appl. Environ. Microbiol.,2010,76(6):1789-1795.

[15] Bernhard A E, Field K G. Identification of nonpoint sources of fecal pollution in coastal waters by using hostspecific16S rDNA genetic Markers from fecal anaerobes [J]. Appl. Environ. Microbiol.,2000,66(4):1587-1594.

[16] Manz W, Amann R, Ludwig W, et al. Application of a suite of16S rRNA specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment [J]. Microbiology,1996,142:1097-1106.

[17] Bernhard A E, Field K G. A PCR assay to discriminate human and ruminant feces on the basis of host differences in Bacteroides-Prevotella genes encoding16S rRNA [J]. Appl. Environ. Microbiol.,2000,66(10):4571-4574.

[18] Reischer G H, Kasper D C, Steinborn R, et al. A quantitative real-time PCR assay for the highly sensitive and specific detection of human faecal influence in spring water from a large alpine catchment area [J]. Appl. Microbiol.,2007,4(4):351-356.

[19] Kildare B J, eutenegger C M, cswain B S,et al.16S rRNA-based assays for quantitative detection of universal,human-,cow-,and dog-specific fecal Bacteroidales:a Bayesian approach [J]. Water Res.,2007,41(16):3701-3715.

[20] Dick L K, Bernhard A E, Brodeur T J, et al. Host distributions of uncultivated fecal Bacteroidales bacteria reveal genetic markers for fecal source identification [J]. Appl. Environ. Microbiol.,2005,71(6):3184-3191.

[21] 張 曦,朱昌雄,朱紅惠.利用擬桿菌分子標(biāo)記物對糞便污染溯源的研究進(jìn)展 [J]. 微生物學(xué)報(bào),2011,51(7):863-868.

[22] Buchanan R E, Gibbons N E. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊 [M]. 中國科學(xué)院微生物研究所翻譯組譯.8版.北京:科學(xué)出版社,1984:535-536.

[23] Fogarty L R, Voytek M A. Comparison of Bacteroides-Prevotella16S rRNA genetic markers for fecal samples from different animal species [J]. Appl. Environ. Microbiol.,2005,71(10):5999-6007.

[24] U.S. Department of Agriculture. Cattle inventory report. U.S. Department of Agriculture [R]. Washington, D.C.2013.

[25] Lee J. Securing a balance between competitive magriculture and environmental protection [C]//Proceedings of the1999 Agri-Food Millennium Conference,1999:116—129.

[26] Shanks O C, Kelty C A, Archibeque S, et al. Community structures of fecal bacteria in cattle from different animal feeding operations [J]. Appl. Environ. Microbiol.,2011,77(9):2992—3001.

[27] Kelty C A, Varma M, Sivaganesan M, et al. Distribution of genetic marker concentrations for fecal indicator bacteria in sewage and animal feces [J]. Appl. Environ. Microbiol.,2012,78(12):4225—4232.

[28] Pruimboom-Brees I M, Organ T W, Ackermann M R, et al. Cattle lack vascular receptors for Escherichia coli O157:H7Shiga toxins [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A,2000,97:10325—10329.

Study on sensitivity and specificity of the Bacteroidales biomarkers for microbial source tracking in the Pearl River Delta region.

WANG Hai-ying1, JIA Le-hua1, WU Ren-ren2,3*, WANG Ju-fang1, NING Zheng-xiang4
(1.School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou510006, China；2.South China Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Guangzhou510655, China；3.The key Laboratory of Water and Air Pollution Control of Guangdong Province, Guangzhou510655, China；4.School of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou510006, China). China Environmental Science,2014,34(8)：2118～2125

A total of33 fecal samples of human and different animal species were collected in the Pearl River Delta region. Genomic DNA were then efficiently extracted and amplified by using14 specific Bacteroidales primers that have been reported as tracking markers of different sources. Primers with high specificity and sensitivity were then selected and used for polluted water samples analysis. The results show that the purity and extract efficiency of the genome DNA meet the requirement of the following experiments.85% of the33 fecal samples analyzed were positive when using Bacteroidales universal primer2#(Bac32F/Bac708R), and most of the mammalian animals and chicken fecal samples were detected as positive samples when use this primer. Human-specific marker3#(HF134F/Bac708R) and4#(HF183F/Bac708R), ruminant-specific marker8#(CF128F /Bac708R)and porcine-specific marker10#(PF163F/Bac708R)showed high sensitivity and specificity in the Pearl River Delta region. Polluted water samples analysis results were the same as the actual type of pollution, implying Bacteroidales universal primer2#, human-specific primer3#and4#and porcine-specific primer10#could be used as pollution tracking markers in the Pearl River Delta region.

t：Bacteroidales；specific markers；sensitivity；specificity；Pearl River Delta region

X172

：A

：1000-6923(2014)08-2118-08

王海鷹(1983-),女,湖南沅江人,博士,主要從事微生物檢測方面研究.

2013-12-02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41303054);廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(S2012040007463);中國博士后科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目(2012M521593);中國博士后科學(xué)基金特別資助項(xiàng)目(2013T60796)

* 責(zé)任作者, 工程師, wurenren@scies.org