孟攀奇　蔡麗靜　張桂華　杜勝利

摘 要：以黃瓜抗霜霉病和感霜霉病親本組合（Q9×Q10）的F2分離群體為試材，采用BSA法篩選到了1個(gè)AFLP引物組合P11M70在抗病池和感病池間表現(xiàn)多態(tài)，抗病池和抗病親本均具有大小約304 bp的特異譜帶，感病池和感病親本均擴(kuò)增出了大小約為301 bp的特異片段。經(jīng)F2單株驗(yàn)證及連鎖分析，該特異片段與霜霉病抗病相關(guān)基因相連鎖，連鎖距離為5.22 cM。對特異片段的測序結(jié)果顯示，兩片段的大小分別為304 bp和301 bp，且2個(gè)片段的差異僅為3個(gè)“A”堿基的插入或缺失以及1個(gè)“C-T”的堿基突變。將該AFLP標(biāo)記成功地轉(zhuǎn)換為了簡單實(shí)用的SCAR標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：黃瓜；霜霉病；抗性相關(guān)基因；分子標(biāo)記

黃瓜霜霉病是黃瓜三大主要病害之一，流行年份可導(dǎo)致黃瓜減產(chǎn)達(dá)30%～50%。應(yīng)用抗病品種防治植物病害是最為經(jīng)濟(jì)、安全、有效的途徑。以往抗病品種的選育主要采用常規(guī)育種技術(shù)，對材料抗病性的鑒定依靠田間鑒定方法，受環(huán)境因素影響較大，鑒定結(jié)果也不夠準(zhǔn)確，即便是采用人工接種抗病鑒定技術(shù)，也由于其病原菌活體寄生的原因而受到季節(jié)限制。分子標(biāo)記技術(shù)的飛速發(fā)展，為利用與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行性狀鑒定提供了一條新途徑。

目前關(guān)于黃瓜霜霉病的分子標(biāo)記研究已有部分報(bào)道。丁國華等[1]找到了1個(gè)RAPD標(biāo)記，與黃瓜霜霉病抗性基因之間的連鎖距離為7.85 cM。白智龍等[2]分春秋兩季進(jìn)行了黃瓜霜霉病抗性QTL的檢測，共檢測到3個(gè)QTLs，其中貢獻(xiàn)率最大的1個(gè)QTL在春秋兩季的貢獻(xiàn)率分別達(dá)到了36.4%和27.3%。張素勤等[3]篩選到了1個(gè)與控制黃瓜霜霉病某個(gè)感病基因連鎖的AFLP標(biāo)記，該標(biāo)記解釋霜霉病抗性表型變異的11.34%。但上述文獻(xiàn)所報(bào)道的分子標(biāo)記與黃瓜霜霉病抗性基因間的遺傳連鎖距離均較遠(yuǎn)，用于黃瓜霜霉病抗性輔助育種尚有較大誤差。

本研究分別以高抗和高感黃瓜霜霉病的2個(gè)材料為親本，配制F2分離群體，采用苗期人工接種抗病性鑒定技術(shù)和田間抗病性直接鑒定方法，對F2分離后代的抗性進(jìn)行了鑒定；同時(shí)，結(jié)合BSA法（分離群體混合分析法）采用AFLP技術(shù)，篩選與黃瓜抗霜霉病性狀基因相連鎖的分子標(biāo)記，為利用分子技術(shù)進(jìn)行黃瓜抗霜霉病輔助育種以及霜霉病抗性基因的克隆奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為高抗和高感黃瓜霜霉病的黃瓜高代自交系Q9、Q10及其F2分離后代。AFLP引物購自上海生工生物工程公司。

試驗(yàn)于2002-2004年在天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司黃瓜研究所完成。

1.2 試驗(yàn)方法

①抗性分離群體的構(gòu)建及黃瓜霜霉病抗病性鑒定 將供試材料播種于塑料溫室中，常規(guī)管理。采用噴霧法于3片真葉期進(jìn)行霜霉病苗期人工接種抗性鑒定。采用呂淑珍等[4]所述的分級標(biāo)準(zhǔn)，分別于接種后7、14、20 d左右調(diào)查霜霉病的發(fā)病情況。

②DNA的提取 選取高抗霜霉病和高感霜霉病的F2單株各5株，組成抗病池和感病池。分單株提取DNA和PCR擴(kuò)增。DNA提取采用CTAB法[5]。

③AFLP分析 參照Vos等[6]的方法進(jìn)行AFLP分析。采用MseI和PstI 2種內(nèi)切酶進(jìn)行基因組DNA的酶切；預(yù)擴(kuò)增引物不含選擇性堿基。

③引物篩選及分子標(biāo)記的驗(yàn)證 對抗、感親本及抗、感池內(nèi)各單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將在抗感親本間及抗感兩池間同時(shí)產(chǎn)生差異譜帶的引物組合，作為與黃瓜霜霉病抗性相關(guān)基因連鎖的候補(bǔ)引物組合；然后利用F2單株對候補(bǔ)引物組合進(jìn)行吻合性驗(yàn)證。

⑤特異片段的測序 特異片段的回收純化參照張桂華[5]的方法。序列測定由大連寶生物公司進(jìn)行。

⑥SCAR標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 根據(jù)測序結(jié)果以及引物設(shè)計(jì)的原則，用primer 3.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。SCAR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min， 58℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸7 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 F2分離群體黃瓜霜霉病抗性的鑒定

根據(jù)分級標(biāo)準(zhǔn)將134個(gè)F2單株分為抗病、中間類型和感病3個(gè)級別，其中抗病單株27株，感病單株32株，中間類型75株，適合性測驗(yàn)分析顯示，基本符合1∶2∶1的分離比例（表1）。表明在本試驗(yàn)所采用的供試材料的遺傳背景下，黃瓜對霜霉病的抗性是由單隱性基因控制的，且中間類型單株田間表現(xiàn)偏向于感病親本，感病相對抗病為顯性且為不完全顯性。

2.2 與黃瓜霜霉病抗病基因相連鎖的分子標(biāo)記的篩選

篩選到76對在雙親間具有多態(tài)性的引物組合，其中共顯性AFLP標(biāo)記（P11M70-304 bp/301 bp）在抗病池和感病池之間也具有相同的多態(tài)性?？共∮H本和抗病池單株都具有304 bp的特異片段，感病親本和感病池單株都有301 bp的特異片段（圖1）。

2.3 候補(bǔ)分子標(biāo)記的驗(yàn)證

用共顯性標(biāo)記P11M70對其他F2單株進(jìn)行了吻合率的驗(yàn)證。在其余124個(gè)F2單株中，共有7株發(fā)生了交換。由此計(jì)算，所篩選到的標(biāo)記與目標(biāo)基因之間的遺傳距離為5.22 cM，圖2為引物組合P11M70在部分F2單株中的驗(yàn)證。

2.4 分子標(biāo)記測序

將目標(biāo)片段回收純化后測序，測序結(jié)果顯示，2個(gè)片段的大小分別為304 bp和301 bp，該2個(gè)片段的差異僅表現(xiàn)在3個(gè)“A”堿基的插入或缺失以及1個(gè)“C-T”的堿基突變。

sequence-1：...AAAAGCAATATTCCCTA...304 bp

sequence-2：...A------GTAATATTCCCTA...301 bp

2.5 SCAR引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增

根據(jù)測序結(jié)果及引物設(shè)計(jì)的一般原則，設(shè)計(jì)了1對特異性引物，譜帶理論大小為220 bp和217 bp。圖3結(jié)果顯示，抗病親本和抗病單株均具有220 bp的特異譜帶，感病親本和感病單株均具有217 bp的特異譜帶。將該AFLP標(biāo)記成功地轉(zhuǎn)換為了簡單實(shí)用的SCAR標(biāo)記。與該片段序列有關(guān)的內(nèi)容已申報(bào)國家發(fā)明專利（專利號為：ZL200410018667.0）。

3 討論與結(jié)論

有關(guān)黃瓜對霜霉病抗性的遺傳規(guī)律，前人進(jìn)行了大量觀察研究?？赡苁茄芯空咚捎玫牟牧系倪z傳背景不同，即抗性基因組成可能不同，加之沒有采用統(tǒng)一的抗性鑒定方法及分級標(biāo)準(zhǔn)，研究結(jié)果各不相同。大多研究結(jié)果認(rèn)為，黃瓜對霜霉病的抗性是由多基因控制[4，7～9]，但也有單基因控制的報(bào)道[10]。本研究對抗霜霉病和感霜霉病親本材料及其F2分離群體進(jìn)行了田間抗病性鑒定和AFLP分子標(biāo)記研究。田間鑒定結(jié)果表明，F(xiàn)2分離群體中抗病、中間類型和感病單株的比例約為1∶2∶1，且中間類型單株的抗病性偏向感病親本，說明在本研究采用的試材的遺傳背景下，黃瓜對霜霉病的抗性是由單隱性基因控制的，感病性相對于抗病性為不完全顯性。

BSA分析方法是Michelmore等[11]于1991年建立的一種連鎖標(biāo)記分析方法。該方法適合由單基因控制的質(zhì)量性狀。但筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，若為完全顯性，很易建立抗感池，若為不完全顯性，在F2后代性狀鑒定分級時(shí)很容易發(fā)生劃分錯(cuò)誤，即便是一個(gè)單株的鑒定失誤也會導(dǎo)致分池不準(zhǔn)確。本研究中黃瓜對霜霉病的抗性就屬不完全顯性，所以參照張桂華等[12]的方法組建抗病池和感病池進(jìn)行標(biāo)記篩選，篩選到了與控制黃瓜霜霉病抗性基因緊密連鎖的AFLP標(biāo)記，并轉(zhuǎn)換為了簡單實(shí)用的SCAR標(biāo)記。

參考文獻(xiàn)

[1] 丁國華，秦智偉，周秀艷，等.黃瓜霜霉病抗病基因的RAPD及SCAR標(biāo)記[J].西北植物學(xué)報(bào)，2007，27（9）：1 747-1 751.

[2] 白智龍，袁曉君，蔡潤，等.黃瓜霜霉病抗性QTL分析[J].自然科學(xué)進(jìn)展，2008，18（6）：706-710.

[3] 張素勤，顧興芳，張圣平，等.黃瓜霜霉病抗性相關(guān)基因的AFLP標(biāo)記[J].西北植物學(xué)報(bào)，2010，30（7）：1 320-1 324.

[4] 呂淑珍，張本群，李淑菊.黃瓜霜霉病抗病遺傳及抗性鑒定方法研究進(jìn)展[C]//中國主要蔬菜抗病育種進(jìn)展.北京：科學(xué)出版社，1995：392-394.

[5] 張桂華.黃瓜白粉病抗性相關(guān)基因的分子標(biāo)記研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2003：23-28.

[6] Vos P， Hongers R， Bleeker M， et al. AFLP： a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Res， 1995， 23（21）： 4 407-4 414.

[7] 馮東昕，李寶棟.主要瓜類作物抗霜霉病育種研究進(jìn)展[J].中國蔬菜，1997（2）：45-48.

[8] 侯鋒.黃瓜[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

[9] Jenkins J M. Studies on the inheritance of downy mildew resistance and of other characters in cucumbers[J]. J Hered， 1946， 37： 267-276.

[10] Van Vliet G J A， Meysing W D. Inheritance of resistance to Psuedoperonospore cubensis Rost. in cucumber（Cucumis sativus L.）[J]. Euphytica， 1974， 23： 251-255.

[11] Michelmore R W， Paranand I， Kessali R V. Identification of markers linked to disease resistance gene by bulked segregant analysis： a rapid method to detect markers in specific genomic regions using segregating populations[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1991， 88： 9 829-9 832.

[12] 張桂華，杜勝利，王鳴，等.與黃瓜抗白粉病基因連鎖的AFLP標(biāo)記的獲得[J].園藝學(xué)報(bào)，2004，31（2）：189-192.

3 討論與結(jié)論

有關(guān)黃瓜對霜霉病抗性的遺傳規(guī)律，前人進(jìn)行了大量觀察研究。可能是研究者所采用的材料的遺傳背景不同，即抗性基因組成可能不同，加之沒有采用統(tǒng)一的抗性鑒定方法及分級標(biāo)準(zhǔn)，研究結(jié)果各不相同。大多研究結(jié)果認(rèn)為，黃瓜對霜霉病的抗性是由多基因控制[4，7～9]，但也有單基因控制的報(bào)道[10]。本研究對抗霜霉病和感霜霉病親本材料及其F2分離群體進(jìn)行了田間抗病性鑒定和AFLP分子標(biāo)記研究。田間鑒定結(jié)果表明，F(xiàn)2分離群體中抗病、中間類型和感病單株的比例約為1∶2∶1，且中間類型單株的抗病性偏向感病親本，說明在本研究采用的試材的遺傳背景下，黃瓜對霜霉病的抗性是由單隱性基因控制的，感病性相對于抗病性為不完全顯性。

BSA分析方法是Michelmore等[11]于1991年建立的一種連鎖標(biāo)記分析方法。該方法適合由單基因控制的質(zhì)量性狀。但筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，若為完全顯性，很易建立抗感池，若為不完全顯性，在F2后代性狀鑒定分級時(shí)很容易發(fā)生劃分錯(cuò)誤，即便是一個(gè)單株的鑒定失誤也會導(dǎo)致分池不準(zhǔn)確。本研究中黃瓜對霜霉病的抗性就屬不完全顯性，所以參照張桂華等[12]的方法組建抗病池和感病池進(jìn)行標(biāo)記篩選，篩選到了與控制黃瓜霜霉病抗性基因緊密連鎖的AFLP標(biāo)記，并轉(zhuǎn)換為了簡單實(shí)用的SCAR標(biāo)記。

參考文獻(xiàn)

[1] 丁國華，秦智偉，周秀艷，等.黃瓜霜霉病抗病基因的RAPD及SCAR標(biāo)記[J].西北植物學(xué)報(bào)，2007，27（9）：1 747-1 751.

[2] 白智龍，袁曉君，蔡潤，等.黃瓜霜霉病抗性QTL分析[J].自然科學(xué)進(jìn)展，2008，18（6）：706-710.

[3] 張素勤，顧興芳，張圣平，等.黃瓜霜霉病抗性相關(guān)基因的AFLP標(biāo)記[J].西北植物學(xué)報(bào)，2010，30（7）：1 320-1 324.

[4] 呂淑珍，張本群，李淑菊.黃瓜霜霉病抗病遺傳及抗性鑒定方法研究進(jìn)展[C]//中國主要蔬菜抗病育種進(jìn)展.北京：科學(xué)出版社，1995：392-394.

[5] 張桂華.黃瓜白粉病抗性相關(guān)基因的分子標(biāo)記研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2003：23-28.

[6] Vos P， Hongers R， Bleeker M， et al. AFLP： a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Res， 1995， 23（21）： 4 407-4 414.

[7] 馮東昕，李寶棟.主要瓜類作物抗霜霉病育種研究進(jìn)展[J].中國蔬菜，1997（2）：45-48.

[8] 侯鋒.黃瓜[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

[9] Jenkins J M. Studies on the inheritance of downy mildew resistance and of other characters in cucumbers[J]. J Hered， 1946， 37： 267-276.

[10] Van Vliet G J A， Meysing W D. Inheritance of resistance to Psuedoperonospore cubensis Rost. in cucumber（Cucumis sativus L.）[J]. Euphytica， 1974， 23： 251-255.

[11] Michelmore R W， Paranand I， Kessali R V. Identification of markers linked to disease resistance gene by bulked segregant analysis： a rapid method to detect markers in specific genomic regions using segregating populations[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1991， 88： 9 829-9 832.

[12] 張桂華，杜勝利，王鳴，等.與黃瓜抗白粉病基因連鎖的AFLP標(biāo)記的獲得[J].園藝學(xué)報(bào)，2004，31（2）：189-192.

3 討論與結(jié)論

有關(guān)黃瓜對霜霉病抗性的遺傳規(guī)律，前人進(jìn)行了大量觀察研究。可能是研究者所采用的材料的遺傳背景不同，即抗性基因組成可能不同，加之沒有采用統(tǒng)一的抗性鑒定方法及分級標(biāo)準(zhǔn)，研究結(jié)果各不相同。大多研究結(jié)果認(rèn)為，黃瓜對霜霉病的抗性是由多基因控制[4，7～9]，但也有單基因控制的報(bào)道[10]。本研究對抗霜霉病和感霜霉病親本材料及其F2分離群體進(jìn)行了田間抗病性鑒定和AFLP分子標(biāo)記研究。田間鑒定結(jié)果表明，F(xiàn)2分離群體中抗病、中間類型和感病單株的比例約為1∶2∶1，且中間類型單株的抗病性偏向感病親本，說明在本研究采用的試材的遺傳背景下，黃瓜對霜霉病的抗性是由單隱性基因控制的，感病性相對于抗病性為不完全顯性。

BSA分析方法是Michelmore等[11]于1991年建立的一種連鎖標(biāo)記分析方法。該方法適合由單基因控制的質(zhì)量性狀。但筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，若為完全顯性，很易建立抗感池，若為不完全顯性，在F2后代性狀鑒定分級時(shí)很容易發(fā)生劃分錯(cuò)誤，即便是一個(gè)單株的鑒定失誤也會導(dǎo)致分池不準(zhǔn)確。本研究中黃瓜對霜霉病的抗性就屬不完全顯性，所以參照張桂華等[12]的方法組建抗病池和感病池進(jìn)行標(biāo)記篩選，篩選到了與控制黃瓜霜霉病抗性基因緊密連鎖的AFLP標(biāo)記，并轉(zhuǎn)換為了簡單實(shí)用的SCAR標(biāo)記。

參考文獻(xiàn)

[1] 丁國華，秦智偉，周秀艷，等.黃瓜霜霉病抗病基因的RAPD及SCAR標(biāo)記[J].西北植物學(xué)報(bào)，2007，27（9）：1 747-1 751.

[2] 白智龍，袁曉君，蔡潤，等.黃瓜霜霉病抗性QTL分析[J].自然科學(xué)進(jìn)展，2008，18（6）：706-710.

[3] 張素勤，顧興芳，張圣平，等.黃瓜霜霉病抗性相關(guān)基因的AFLP標(biāo)記[J].西北植物學(xué)報(bào)，2010，30（7）：1 320-1 324.

[4] 呂淑珍，張本群，李淑菊.黃瓜霜霉病抗病遺傳及抗性鑒定方法研究進(jìn)展[C]//中國主要蔬菜抗病育種進(jìn)展.北京：科學(xué)出版社，1995：392-394.

[5] 張桂華.黃瓜白粉病抗性相關(guān)基因的分子標(biāo)記研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2003：23-28.

[6] Vos P， Hongers R， Bleeker M， et al. AFLP： a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Res， 1995， 23（21）： 4 407-4 414.

[7] 馮東昕，李寶棟.主要瓜類作物抗霜霉病育種研究進(jìn)展[J].中國蔬菜，1997（2）：45-48.

[8] 侯鋒.黃瓜[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

[9] Jenkins J M. Studies on the inheritance of downy mildew resistance and of other characters in cucumbers[J]. J Hered， 1946， 37： 267-276.

[10] Van Vliet G J A， Meysing W D. Inheritance of resistance to Psuedoperonospore cubensis Rost. in cucumber（Cucumis sativus L.）[J]. Euphytica， 1974， 23： 251-255.

[11] Michelmore R W， Paranand I， Kessali R V. Identification of markers linked to disease resistance gene by bulked segregant analysis： a rapid method to detect markers in specific genomic regions using segregating populations[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1991， 88： 9 829-9 832.

[12] 張桂華，杜勝利，王鳴，等.與黃瓜抗白粉病基因連鎖的AFLP標(biāo)記的獲得[J].園藝學(xué)報(bào)，2004，31（2）：189-192.