王蓓

（江蘇省揚(yáng)州商務(wù)高等職業(yè)學(xué)校，江蘇 揚(yáng)州 225127）

袖珍菇（P1eurotusgeesteranus Singer），別名小平菇，環(huán)柄側(cè)耳，隸屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬。它具有甜香的海鮮型氣味，其味道鮮美，富含蛋白質(zhì)、多糖、維生素和鐵、鈣等微量元素，且含有人體所必需的8種氨基酸，長(zhǎng)期食用有降低高血壓和降低膽固醇的功能，是開發(fā)前景十分廣闊的珍貴食用菌。

食用菌具有多種功效因子和較高的藥用價(jià)值。歸納起來，食用菌中的多糖]主要有以下幾方面的保健功效[1]。

（1）增強(qiáng)機(jī)體免疫力；（2）抑制腫瘤作用；（3）降低膽固醇、降血壓和抗血栓作用；（4）抗疲勞、抗衰老作用；（5）抗病毒作用；（6）抗氧化作用。

食用菌多糖具有多方面的活性，特別是增強(qiáng)人體免疫力，且對(duì)正常細(xì)胞無毒害作用，因此隨著對(duì)食用菌多糖的研究的不斷加強(qiáng)，食用菌多糖必將在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有很大的潛在發(fā)展空間和前景。本文以袖珍菇為原料進(jìn)行多糖技術(shù)提取研究。

1 材料和方法

1.1 原料與設(shè)備

1.1.1 原料

新鮮袖珍菇：市售。

1.1.2 試劑

乙醚（分析純）、氯仿、正丁醇（分析純）、無水乙醇（分析純）、60%的乙醇、70%的乙醇、80%的乙醇、濃硫酸（分析純）、苯酚（分析純）、葡萄糖（分析純）。

1.1.3 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070）：上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-S26）：河南省鞏義市英峪予華儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52D）：上海青浦滬西儀器廠；循環(huán)水真空泵（SHZ-ⅢB）：上海儀表（集團(tuán)）供銷公司；磁力攪拌器（84-1A）：上海閔行虹浦儀器廠；離心機(jī)（centrifuge5804）：基因有限公司；電子天平AB54型：瑞士METTLER TOLEDO；高速萬能粉碎機(jī)（A11 basic）：廣州儀科公司；分光光度計(jì)：上海凌光技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

將市售的新鮮袖珍菇，置于烘箱內(nèi)40℃烘干，用粉碎機(jī)粉碎，存放在干燥容器備用。

1.2.2 袖珍菇多糖含量的測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用硫酸-苯酚[2]法。糖在濃硫酸的作用下，水解生成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚縮合成橙黃色化合物，且顏色穩(wěn)定，在波長(zhǎng)490 nm處和一定的濃度范圍內(nèi)，其吸光度與多糖含量呈線性關(guān)系正比，從而可以利用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品的多糖含量。

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖100 mg于100 mL容量瓶中，加水至刻度，吸取10 mL，再定容至50 mL，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mg/mL。分別吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg 以蒸餾水補(bǔ)至 2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL搖勻，室溫靜置10 min，于490 nm測(cè)吸光度，以2.0 mL水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為多糖濃度，縱坐標(biāo)為吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，用excel軟件求得回歸方程。

表1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度Table 1 The absorbency polysaccharide standard curve

圖1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Polysaccharide standard curve

1.2.3 熱水浸提法提取袖珍菇多糖

1.2.3.1 工藝流程[3]

袖珍菇粉末→熱水浸提→多糖浸提液→去雜蛋白→乙醇沉淀→檢測(cè)多糖含量。

稱取2 g袖珍菇粉末加入一定的水倒入燒杯內(nèi)攪拌，放在恒溫水浴鍋內(nèi)恒溫到試驗(yàn)溫度，浸提一定的時(shí)間，提取完畢后，對(duì)提取液進(jìn)行抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸餾，將 Sevag（V氯仿∶V正丁醇=4∶1）試劑加入到濾液中，使樣品中的蛋白質(zhì)變性成不溶狀態(tài)沉淀離心除去，然后再加入一定濃度的乙醇溶液在一定溫度下沉淀特定的時(shí)間，離心30 min，棄去上清液，得黃褐色沉淀，分別加入100 mL水復(fù)溶，得粗多糖溶液。

樣品測(cè)定：吸取2 mL樣品液于試管中，加入6%苯酚溶液1 mL，混勻，再加濃硫酸5 mL，充分混合，放置10 min，按試驗(yàn)方法測(cè)定吸光度，由于分光光度計(jì)只能測(cè)顏色較淺的溶液，所以實(shí)際測(cè)量時(shí)將上面的樣品稀釋10倍，為避免誤差，吸光度多次測(cè)量求取平均值，計(jì)算多糖含量。

1.2.3.3 料液比對(duì)袖珍菇多糖得率的影響

設(shè)定浸提時(shí)間1 h，溫度60℃，醇沉濃度80%，醇沉?xí)r間4 h，醇沉溫度25℃，以多糖得率為指標(biāo)，對(duì)料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（mg/mL）進(jìn)行比較研究，確定最佳料液比。

1.2.3.4 浸提時(shí)間對(duì)袖珍菇多糖得率的影響

設(shè)定浸提料液比 1∶20（mg/mL），溫度 60 ℃，醇沉濃度80%，醇沉?xí)r間4 h，醇沉溫度25℃，以多糖得率為指標(biāo)，對(duì)浸提時(shí)間 1、2、3、4、5 h 進(jìn)行比較研究，確定最佳時(shí)間。

1.2.3.5 浸提溫度對(duì)袖珍菇多糖得率的影響

式中：xq為需求某點(diǎn)X軸坐標(biāo)值，m；yq為需求某點(diǎn) Y軸坐標(biāo)值，m；zq為需求某點(diǎn) Z軸高程，m；xg、xd為已知點(diǎn)X軸坐標(biāo)值，m；yg、yd為已知點(diǎn) Y軸坐標(biāo)值，m；zg、zd已知點(diǎn) Z 軸高程，m；

設(shè)定浸提料液比 1∶20（mg/mL），時(shí)間 1 h，醇沉濃度80%，醇沉?xí)r間4 h，醇沉溫度25℃，以多糖得率為指標(biāo)，對(duì)浸提溫度 60、70、80、90、100 ℃進(jìn)行比較研究，確定最佳溫度。

1.2.3.6 乙醇濃度對(duì)袖珍菇多糖得率的影響

設(shè)定浸提料液比 1∶20（mg/mL），時(shí)間 1 h，溫度60℃，醇沉?xí)r間4 h，醇沉溫度25℃，以多糖得率為指標(biāo)，對(duì)乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行比較研究，確定最佳濃度。

1.2.3.7 醇沉溫度對(duì)袖珍菇多糖得率的影響

設(shè)定浸提料液比 1∶20（mg/mL），時(shí)間 1 h，溫度60℃，醇沉?xí)r間4 h，醇沉濃度60%，以多糖得率為指標(biāo)，對(duì)醇沉溫度4、25、40℃進(jìn)行比較研究，確定最佳溫度。

1.2.3.8 醇沉?xí)r間對(duì)袖珍菇多糖得率的影響

設(shè)定浸提料液比 1∶20（mg/mL），時(shí)間 1 h，溫度60℃，醇沉溫度25℃，醇沉濃度60%，以多糖得率為指標(biāo)，對(duì)醇沉?xí)r間 4、6、8、10、12 h 進(jìn)行比較研究，確定最佳時(shí)間。

1.2.3.9 正交試驗(yàn)

熱水浸提法條件優(yōu)化：

以料液比，浸提溫度和浸提時(shí)間為直接因素，進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)。其中料液比水平為1∶20、1∶30、1∶40（mg/mL），浸提溫度水平為 70、80、90 ℃，浸提時(shí)間水平為 1、2、3 h。

乙醇沉淀多糖工藝條件優(yōu)化：

在料液比 1∶20（mg/mL），浸提溫度 60 ℃，浸提時(shí)間1 h的相同條件下得到的浸提液，選取乙醇濃度，沉淀時(shí)間和沉淀溫度為直接因素，進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，其中乙醇濃度水平為60%、70%、80%，醇沉?xí)r間水平為 4、8、12 h，醇沉溫度水平為 4、25、40℃。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 加水量對(duì)秀珍菇多糖得率的影響

采用不同的加水比例，其他試驗(yàn)條件完全相同，以多糖得率為指標(biāo)，以確定最佳料液比，結(jié)果見表2。

表2 料液比對(duì)袖珍菇多糖得率的影響Table 2 Mushroom polysaccharides material liquid extraction ratio effects of pocket

圖2 料液比對(duì)袖珍菇多糖得率的影響Fig.2 Material liquid extraction ratio effects of pocket mushroom polysaccharides

由圖2可知，水的不同用量對(duì)袖珍菇多糖的得率有較大影響，隨體系水含量的增加，其多糖得率呈現(xiàn)先上升后趨于穩(wěn)定。隨著料液比的增加，多糖與有水接觸面的濃度差增大，多糖就越容易滲透出來，當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)，袖珍菇中的多糖絕大部分已被溶解出來，結(jié)果表明，料液比在1∶40時(shí)多糖濃度達(dá)最高。結(jié)合生產(chǎn)成本，故選用料液比為 1∶20、1∶30、1∶40 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 浸提時(shí)間對(duì)秀珍菇多糖得率的影響

對(duì)于浸提時(shí)間，在設(shè)定浸提溫度60℃，料液比1∶40的條件下，以多糖得率為指標(biāo)，確定最佳浸提時(shí)間，其結(jié)果見表3。

表3 浸提時(shí)間對(duì)袖珍菇多糖得率的影響Table 3 Extraction time for pocket mushroom polysaccharides extraction

圖3 浸提時(shí)間對(duì)袖珍菇多糖得率的影響Fig.3 Extraction time for pocket mushroom polysaccharides extraction

由圖3可知，浸提時(shí)間越長(zhǎng)，熱水對(duì)物料作用的越充分，多糖浸出的越多，袖珍菇多糖的得率增加。當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，多糖得率達(dá)到最大值，然后下降，這是由于隨著時(shí)間增長(zhǎng)，溶液體系濃度達(dá)到平衡。從圖中可以看出，浸提2 h可以對(duì)袖珍菇多糖進(jìn)行充分提取。因此，本試驗(yàn)選擇1、2、3 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3 浸提溫度對(duì)秀珍菇多糖得率的影響

以浸提溫度為單一變量，其他條件完全相同，以多糖得率為指標(biāo)，確定最佳浸提溫度，其結(jié)果見表4。

表4 浸提溫度對(duì)袖珍菇多糖得率的影響Table 4 Extraction of pocket mushroom polysaccharides extraction temperature

圖4 浸提溫度對(duì)袖珍菇多糖得率的影響Fig.4 Extraction of pocket mushroom polysaccharides extraction temperature

由圖4可以看出，浸提溫度高低對(duì)袖珍菇多糖得率影響比較明顯。隨著浸提溫度的增高，多糖得率先增加，然后略有下降。這可能是由于溫度升高，空化作用和機(jī)械作用越劇烈，媒質(zhì)粒子的速度和加速度亦越大，界面擴(kuò)散層上的分子擴(kuò)散就越快，使袖珍菇中的多糖滲出速度就越快。但溫度過高，袖珍菇中其它成分吸出，導(dǎo)致多糖得率緩慢下降。所以本試驗(yàn)選擇70、80、90℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

由單因素試驗(yàn)可以看出，每種單一的因素達(dá)到一定程度時(shí)，對(duì)提高多糖得率都有一定的難度，必須綜合多個(gè)因素，確定出合理的水平，才能得到理想的袖珍菇多糖提取工藝參數(shù)。因此，在各單因素初步試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇了各因素的3個(gè)水平，以多糖的得率作為參考指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定袖珍菇多糖提取最佳工藝參數(shù)[4]，結(jié)果見表 5。

表5 不同浸提條件下的袖珍菇多糖提取效果Table 5 Under the condition of different extraction ofmushroom polysaccharides extract pocketbook

從表5可以看出，R值以料液比（0.211）最大，溫度（0.040）其次，提取時(shí)間（0.037）最小。表明料液比決定袖珍菇多糖得率的主要影響因素，其次是浸提溫度和提取時(shí)間。

從K值可以看出，料液比以 1∶40（mg/mL）處理提取效率最高，浸提時(shí)間以3 h處理提取效率最高，浸提溫度以80℃提取效率最高。將3個(gè)因素的最優(yōu)水平結(jié)合在一起得最佳浸提條件：料液比1∶40（mg/mL），時(shí)間3 h，浸提溫度80℃。

按照最佳提取條件進(jìn)行了驗(yàn)證，得出的多糖得率為0.931%，高于其他條件的得率，因此認(rèn)為此工藝條件是可行的。

以上試驗(yàn)采用水作為浸提液對(duì)秀珍菇多糖進(jìn)行了試驗(yàn)研究。對(duì)于多糖的得率中，我們還有一個(gè)重要的因素就是醇沉條件，下面對(duì)乙醇沉淀濃度、沉淀溫度、沉淀時(shí)間進(jìn)行了研究。

2.5 乙醇濃度對(duì)袖珍菇多糖得率的影響

對(duì)乙醇濃度我們采用了50%、60%、70%、80%、90%濃度的乙醇，在其他試驗(yàn)條件完全一定的條件下，以多糖得率為指標(biāo)，確定最佳乙醇濃度，其結(jié)果見表6。

表6 乙醇濃度對(duì)袖珍菇多糖得率的影響Table 6 The concentration of ethanol extraction mushroom polysaccharides pocketbook

圖6 乙醇濃度對(duì)袖珍菇多糖得率的影響Fig.6 The concentration of ethanol extraction mushroom polysaccharides pocketbook

由圖6，乙醇濃度在50%～70%時(shí)隨著乙醇濃度的升高多糖得率也升，乙醇濃度超過70%以后隨著濃度升高多糖提取率反而下降，所以得最佳乙醇濃度70%。

2.6 醇沉溫度對(duì)袖珍菇多糖得率的影響

對(duì)乙醇溫度采用了4、25、40℃。浸提時(shí)間1 h，溫度60℃，醇沉?xí)r間4 h，醇沉濃度60%，以多糖得率為指標(biāo)，其結(jié)果見表7。

表7 醇沉溫度對(duì)袖珍菇多糖得率的影響Table 7 Alcohol extraction temperature on the mushroom polysaccharides pocketbook

由圖7得出，醇沉?xí)r醇沉溫度在25℃范圍內(nèi)隨著溫度上升多糖得率升高，過了25℃以后，隨著溫度上升多糖得率反而下降，由此得出最佳醇沉溫度25℃。

2.7 乙醇醇沉?xí)r間對(duì)袖珍菇多糖得率的影響

對(duì)醇沉?xí)r間采用了 4、6、8、10、12 h。浸提時(shí)間 1 h，溫度60℃，醇沉溫度4℃，醇沉濃度60%，以多糖得率為指標(biāo)，其結(jié)果見表8。

圖7 醇沉溫度對(duì)袖珍菇多糖得率的影響Fig.7 Alcohol extraction temperature on the mushroom polysaccharides pocketbook

表8 醇沉?xí)r間對(duì)袖珍菇多糖得率的影響Table 8 Alcohol extraction time to a small mushroom polysaccharides

圖8 醇沉?xí)r間對(duì)袖珍菇多糖得率的影響Fig.8 Alcohol extraction time to a small mushroom polysaccharides

以圖8看，醇沉?xí)r間在8 h之內(nèi)隨著時(shí)間的增加多糖得率逐漸上升，8 h以后隨著時(shí)間增加得率反而下降，多糖得率在醇沉8 h時(shí)達(dá)到最大值，所以醇沉最佳時(shí)間8 h。

2.8 不同醇沉條件正交試驗(yàn)結(jié)果

從以上單因素試驗(yàn)可以看出，每種單一的因素達(dá)到一定程度時(shí)，對(duì)提高多糖濃度都有一定的難度，必須綜合多個(gè)因素，確定出合理的水平，才能得到理想的多糖醇沉的工藝參數(shù)。因此根據(jù)以上各單因素多水平的初步試驗(yàn)，選擇了各因素的3個(gè)水平，以多糖得率作為參考指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，來確定袖珍菇多糖醇沉工藝參數(shù)[5]，結(jié)果見表 9。

從表9可以看出，R值以醇沉溫度（0.128）最大，醇沉?xí)r間（0.167）次之，乙醇濃度（0.069）最小。表明醇沉溫度對(duì)袖珍菇多糖的得率影響最大，乙醇濃度影響最小。

表9 不同醇沉條件的袖珍菇多糖提取效果Table 9 Different alcohol extract of pocket mushroom polysaccharides conditions

同時(shí)可以得出，醇沉溫度以4℃處理多糖含量最高，但4℃與25℃條件下醇沉?xí)r多糖的得率相差甚微，考慮到節(jié)約能源，采用25℃醇沉溫度進(jìn)行醇沉較為適宜；醇沉?xí)r間4 h處理多糖含量達(dá)到最大值；醇沉?xí)r乙醇濃度60%處理多糖得率最高。將3個(gè)因素的最優(yōu)水平結(jié)合在一起，得到優(yōu)化的醇沉條件的組合。結(jié)果確定，最佳的醇沉條件為醇沉濃度60%，醇沉?xí)r間8 h，醇沉溫度25℃。

按照最佳醇沉條件進(jìn)行了驗(yàn)證，得到的多糖得率為0.775%，高于其他條件的得率，所以此工藝條件有可行性。

綜合以上兩個(gè)正交試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果，以料液比1∶40（mg/mL），浸提時(shí)間 3 h，浸提溫度 80 ℃，醇沉?xí)r乙醇濃度60%，醇沉?xí)r間8 h，醇沉溫度25℃為實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了驗(yàn)證，得到的多糖得率為0.968%，高于其他條件下的多糖得率，因此這工藝條件是可行的。

3 結(jié)論

熱水浸提法相對(duì)于其它方法而言具有設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，適用面廣以及節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)本試驗(yàn)在用熱水浸提法提取袖珍菇多糖的工藝中通過單因素和正交試驗(yàn)得出了袖珍菇多糖的最佳提取工藝參數(shù)：料液比 1∶40（mg/mL），浸提溫度 80 ℃，浸提時(shí)間 3 h，醇沉?xí)r乙醇的濃度60%，醇沉?xí)r間8 h，醇沉溫度25℃，在此條件下多糖的得率為0.968%。

近年來，食用菌多糖[6]的研究和應(yīng)用已取得很大的進(jìn)步，但仍存在許多問題，總結(jié)起來主要有以下三個(gè)問題：第一，是食用菌多糖的構(gòu)效關(guān)系研究。有廣泛生理活性的食用菌多糖活性強(qiáng)弱與分子組成、連接方式、立體構(gòu)型、相對(duì)分子量、糖鏈的分支程度、溶解度等有密切關(guān)系。多糖官能團(tuán)的改造已成為研究多糖構(gòu)效關(guān)系的有效手段。目前人們對(duì)食用菌多糖構(gòu)效關(guān)系的研究還僅限于對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究，還很不完善，須在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上，加快多糖結(jié)構(gòu)研究的速度，爭(zhēng)取在方法上有突破，深入了解其生物活性。第二，是食用菌多糖的提取純化研究。隨著對(duì)多糖認(rèn)識(shí)的不斷加深，尋找一種有效的提取方法是迫切需要解決的問題。目前提取多糖的方法很多，每種都有其優(yōu)缺點(diǎn)。要根據(jù)提取物的性質(zhì)、提取成本、工藝設(shè)備等選擇適合的提取方法，提高多糖類的提取率，減少原材料的消耗[6]。第三，是食用菌多糖活性功能機(jī)理的研究?，F(xiàn)人們對(duì)食用菌多糖的藥理研究已有相當(dāng)一段時(shí)間，雖取得較大進(jìn)展，但創(chuàng)新研究很少?，F(xiàn)在在這方面的研究多側(cè)重在利用一些免疫指標(biāo)分析其生物活性和免疫機(jī)理。

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