仇鯨翔 陳俐娟

（四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都，610064）

我國常用中藥材厚樸為木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）或凹葉厚樸的干燥干皮、根皮及枝皮，具有燥濕消痰、下氣除螨之功效，用于食積氣滯，腹脹便秘，痰飲喘咳等?，F(xiàn)代藥理研究表明，厚樸具有影響胃腸活動(dòng)、抗菌、鎮(zhèn)咳、肌肉松弛和中樞抑制等作用［1］。和厚樸酚（Honokio1）帶有烯丙基的連苯二酚類化合物—是厚樸的主要化學(xué)成分。研究人員發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚表現(xiàn)出多種藥理作用，如抗炎、抗心律失常、抗癲癇［2］、抗血小板聚集等。此外，有研究報(bào)道和厚樸酚還可以抑制氮氧化產(chǎn)物和腫瘤壞死因子TNF的產(chǎn)生［2－4］。為了尋找和開發(fā)高效、低毒的抗腫瘤活性化合物，我們以和厚樸酚為母體，通過“Mannich反應(yīng)”對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成了數(shù)個(gè)和厚樸酚的衍生物，采用MTT法測(cè)試了和厚樸酚衍生物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的毒性作用，并進(jìn)一步采用細(xì)胞流式分析手段研究了和厚樸酚衍生物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

和厚樸酚（Honokiol）購買于成都科華生物技術(shù)公司（純度大于99%），和厚樸酚衍生物本實(shí)驗(yàn)室合成，合成過程參照本實(shí)驗(yàn)室的研究成果，同時(shí)略作修改［6］，用純度大于99%的二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成40μM的儲(chǔ)存液備用，其中，DMEM及RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS）等試劑均購自蘭州民海生物公司。四氮唑鹽（MTT）：Sigma公司產(chǎn)品，使用前先用生理鹽水配制成5g／L儲(chǔ)存液，二甲基亞砜（DMSO）：Sigma公司產(chǎn)品，其余普通試劑均為國產(chǎn)的分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 化合物合成

某些酚類化合物可以和一分子甲醛及胺發(fā)生Mannich反應(yīng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的研究結(jié)果［5］，我們通過微波促進(jìn)的Mannich反應(yīng)對(duì)和厚樸酚酚羥基臨位進(jìn)行修飾，合成了以下1＃H—6＃H衍生物。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞采用實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)，該細(xì)胞于含10%胎牛血清、100U／mL青霉素和100mg／L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置飽和濕度37度的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 MTT試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞單個(gè)核細(xì)胞，以5×104個(gè)細(xì)胞／孔的密度接種于96孔板中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組設(shè)立8個(gè)藥物濃度組，每組HNK的終濃度為5、10、15、20、25、30、35、40μg／mL，每個(gè)藥物濃度組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入同樣濃度的二甲基亞砜（DMSO），每個(gè)劑量五個(gè)平行孔。分別于12、24、48小時(shí)取一塊96孔培養(yǎng)板，板中每孔加入新鮮配制的濃度為5mg／mL的MTT 20μL。繼續(xù)培養(yǎng)3h后取出培養(yǎng)板，小心吸棄培養(yǎng)基，每孔加DMSO 150 μL，輕輕震蕩10分鐘后，用酶標(biāo)儀于490nm處測(cè)出各孔吸光度值OD，近下式計(jì)算細(xì)胞抑制率：根據(jù)公式：細(xì)胞抑制率（%）＝（1－給藥孔平均OD值／對(duì)照孔平均OD值）×100%。

圖1 1＃H—6＃H化合物的合成

1.2.4 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Sub凋亡峰

收集藥物作用后的HepG2細(xì)胞，用PBS洗一次，用預(yù)冷的70%乙醇于4度固定至少12h。離心后的細(xì)胞并用PBS沖洗、再用含50mg／L的PI，l g／L RNAase及0.1%Triton X－100的染料溶液冰浴避光孵育30min后。流式細(xì)胞儀分析。激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)630nm。DNA含量少于正常二倍體細(xì)胞的亞二倍體細(xì)胞比率計(jì)為凋亡比率。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，檢測(cè)的調(diào)亡數(shù)據(jù)比例用SPSS 13.0軟件中的ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，主要檢測(cè)各種數(shù)據(jù)間是否存在差異的顯著性，P值小于0.05視為具有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 和厚樸酚衍生物抗增殖活性比較

為了比較和厚樸酚衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞抗增殖活性，我們采用MTT法測(cè)定了和厚樸酚及其衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞 HepG2、K562、SMMC－7221、LO2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果如表1和圖2所示，從表1中可以看出，和厚樸酚3＃H衍生物的抗性最強(qiáng)，而6種衍生物的抗增殖活性存在劑量依存關(guān)系，這些劑量依存關(guān)系我們用軟件分析后發(fā)現(xiàn)具有較好的劑量與效果的依存線性關(guān)系，這些線性關(guān)系表明和厚樸酚衍生物能夠較好的抑制腫瘤細(xì)胞抗增殖。

表1 6個(gè)和厚樸酚衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞抗增殖活性

圖2 和厚樸酚衍生物抑制HepG2細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果

2.2 和厚樸酚衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞HepG2形態(tài)的影響

在顯微鏡下觀察到正常HepG2細(xì)胞狀態(tài)良好，均勻的貼附于培養(yǎng)板底面，而和厚樸酚衍生物3＃H作用細(xì)胞12h后，細(xì)胞皺縮，浮起變圓，核周邊出芽，形成很多凋亡小體。

2.3 和厚樸酚衍生物誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡的比率

在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞發(fā)生凋亡，DNA斷裂，染色體片段化，為了證明凋亡，并檢測(cè)凋亡比率，可用流式細(xì)胞儀PI染色法分析。正常HepG2細(xì)胞無亞二倍體峰（G0／G1期）（3%），而加入和厚樸酚衍生物3＃H處理后，二倍體峰前面出現(xiàn)明顯的凋亡特征的亞二倍體峰（29.4%）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)表明與未經(jīng)處理組有顯著性差異。

3 討論

細(xì)胞凋亡（apoptosis）即程序性細(xì)胞死亡是一種重要的生物學(xué)行為。細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮，與周圍的細(xì)胞連接消失，胞質(zhì)凝縮，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞骨架解體，胞膜完整，最終形成膜包裹的凋亡小體，無內(nèi)容物外溢，不引起炎性反應(yīng)，凋亡小體可迅速被周圍吞噬細(xì)胞吞噬。抗腫瘤藥物通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖與促進(jìn)細(xì)胞凋亡來殺傷腫瘤細(xì)胞。

在本次實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)和厚樸酚衍生物體外抗腫瘤活性通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖，阻斷細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)。在這些化合物中和厚樸酚衍生物3＃H體外抗腫瘤活性最強(qiáng)。以前研究報(bào)道5－甲?；梢燥@著增加和厚樸酚在K562、SPC－A1和A549上的抗增殖活性［6］。我們結(jié)果顯示和厚樸酚衍生物3＃H極大地提高了和厚樸酚的抗增殖活性。在本實(shí)驗(yàn)中我們處理細(xì)胞24h后：和厚樸酚處理組只有1＃H這個(gè)厚樸酚衍生物的誘發(fā)細(xì)胞凋亡效果比較差外，其他和厚樸酚衍生物效果比較好。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，1＃H既沒有抑制細(xì)胞增殖也沒有誘發(fā)細(xì)胞凋亡；2＃H、4＃H、5＃H和6＃H處理組與對(duì)照組相比顯著抑制細(xì)胞的增殖，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核形態(tài)出現(xiàn)凋亡特征；3＃H處理組大量的細(xì)胞從板底脫落，細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的凋亡特征：細(xì)胞核固縮，染色體凝縮，細(xì)胞核變得不規(guī)則出現(xiàn)月牙狀。形態(tài)學(xué)和PI流式結(jié)果證實(shí)厚樸酚處理后HepG2細(xì)胞凋亡率增加。提示厚樸酚在小細(xì)胞肺癌治療中具有應(yīng)用價(jià)值。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：235.

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