王青松，胡曉倩

（北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物基礎(chǔ)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100871）

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一種在美國西北海岸生長的名為Aequorea victoria的維多利亞水母中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。GFP全長共238個(gè)氨基酸，分子量約為27kDa，它的發(fā)光核心是由第65至67個(gè)氨基酸（絲氨酸－酪氨酸－甘氨酸）殘基組成的結(jié)構(gòu)域，可自發(fā)地形成一種熒光發(fā)色團(tuán)，在波長395 nm的紫外光激發(fā)下可產(chǎn)生綠色熒光［1－4］。自1962年日裔科學(xué)家下村修在維多利亞水母中發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白至今，GFP已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達(dá)純化、蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)定位示蹤和模式生物轉(zhuǎn)基因等生物學(xué)研究中［5－8］。

SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）對蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離，是生物學(xué)研究中廣泛使用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)（western blotting）是利用抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的經(jīng)典的對復(fù)雜體系中靶蛋白定性和半定量的技術(shù)，蛋白質(zhì)經(jīng)高分辨率SDS－PAGE分離并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到膜上進(jìn)行免疫化學(xué)分析，在生物學(xué)研究中廣泛使用［9－11］。蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)自2002年獲諾貝爾化學(xué)獎以來的10多年時(shí)間里飛速發(fā)展，在蛋白質(zhì)鑒定、定量和翻譯后修飾分析方面發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用，是現(xiàn)代生物學(xué)研究中的前沿實(shí)驗(yàn)技術(shù)［12－13］。為提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能，本實(shí)驗(yàn)選擇GFP作為實(shí)驗(yàn)對象，設(shè)計(jì)包括GFP的原核蛋白表達(dá)、鎳柱親和純化、熒光光譜分析、SDS－PAGE電泳分離、免疫印跡和質(zhì)譜鑒定等內(nèi)容的生物化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的綜合性和研究性。

1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

鎳親和介質(zhì)購自美國GE Heathcare公司；Blue plus蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司（包含6種已知相對分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，16kDa～94kDa）；兔抗GFP多克隆抗體在中國科學(xué)院動物所制備；羊抗兔二抗購自北京集思佳揚(yáng)生物科技有限公司；NaCl、KCl、Tris、glycine、乙醇、甲醇、磷酸、SDS、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O 和碳酸氫銨購自北京化學(xué)試劑公司；脫脂奶粉購自內(nèi)蒙古伊利集團(tuán)；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)G－250、Tween－20和胰蛋白酶購自美國 Merck公司；PVDF膜購自美國Bio－rad公司；胰蛋白胨、酵母提取物、咪唑、IPTG、乙腈和甲酸購自美國Sigma公司。

2 實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫?fù)u床（北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司）；臺式低速離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器廠）；玻璃層析柱（內(nèi)徑1cm×長10cm，自制）；蛋白核酸檢測儀及記錄儀（美國GE Heathcare公司）；Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（美國ThermoFisher公司）；SE250小型垂直板電泳槽及電源（美國GE Heathcare公司）；凝膠成像儀（法國Vilber Lourmat公司）；脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；金屬?。ū本┙疸y杏生物科技有限公司）；Trans－Blot Turbo蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio－rad公司）；LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀（美國ThermoFisher公司）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 搖菌/誘導(dǎo)表達(dá)

從－80℃保存的含有pET28a－GFP質(zhì)粒的表達(dá)菌種中挑取少量碎冰菌屑，接種于含有7mL的LB液體培養(yǎng)基（10g/L 胰蛋白胨，5g/L 酵母提取物，10 g/L氯化鈉，100mg/L卡那霉素）的小試管中，37℃搖床200r/min培養(yǎng)過夜；取2mL過夜培養(yǎng)的菌液放入500mL的LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，搖床200r/min培養(yǎng)至OD600值為0.8時(shí)加入終濃度為100mg/L的IPTG，放入37℃中6h誘導(dǎo)GFP的表達(dá)。

3.2 裂解提取

將誘導(dǎo)表達(dá)GFP后的菌液在4℃、7 000 g離心20min，棄去上清后，加入40mL的裂解緩沖液（30 mmol/L Tris，10mmol/L 咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.5），放入－80℃冰箱2h以上；取出融化后用超聲破碎菌體，超聲10s、停5s，超聲30次后放置5 min，再次超聲30次。于20 000 g、4℃離心20min后取上清。

3.3 鎳柱親和純化

使用裂解緩沖液（30mmol/L Tris，10mmol/L 咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.5）平衡鎳柱5個(gè)柱體積后開始上樣；上樣后用裂解緩沖液洗2～5個(gè)柱體積洗去雜蛋白；然后用含有30mmol/L咪唑的緩沖液（30 mmol/L Tris，30mmol/L 咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.5）洗雜蛋白2～5個(gè)柱體積；最后用含有250mmol/L咪唑的洗脫緩沖液（30mmol/L Tris，250mmol/L咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.5）洗脫至紫外吸收峰走平為止；收集洗脫液，用10kDa的50mL的Millipore超濾離心管超濾除去咪唑，將溶液置換為30mmol/L的Tris緩沖液（pH 8.5），分裝凍存于－80℃［9］。

3.4 熒光光譜掃描分析

利用Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀測定純化后GFP的激發(fā)光波長與發(fā)射光波長。將100μL的GFP溶液（質(zhì)量濃度2g/L）加入96孔板中，放入多功能讀數(shù)儀，選擇熒光連續(xù)光譜掃描方式。首先固定激發(fā)波長為470nm，設(shè)置掃描發(fā)射波長范圍為470～600nm，掃描波長間隔為2nm，運(yùn)行發(fā)射光掃描，得到最佳發(fā)射光檢測波長。根據(jù)檢測結(jié)果固定最佳發(fā)射光波長，再進(jìn)行激發(fā)光譜掃描，設(shè)置掃描激發(fā)波長范圍300～500nm，掃描波長間隔為2nm，運(yùn)行激發(fā)光掃描，得到最佳激發(fā)光檢測波長。根據(jù)檢測結(jié)果可得到GFP樣品的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。

3.5 SDS－PAGE凝膠電泳

配制5%的濃縮膠和12.5%的分離膠。上樣后樣品進(jìn)入濃縮膠時(shí)的電壓為100V；待樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)為150V，待指示染料遷移至下沿約1cm處停止電泳；電泳后，將凝膠取出，把凝膠分為兩部分，分別用于考馬斯亮藍(lán)染色和蛋白轉(zhuǎn)印。將一部分凝膠放入容器中，加入考馬斯亮藍(lán)G－250染色液（0.01%考馬斯亮藍(lán)G－250，5%乙醇，8.5%磷酸），搖床溫和振蕩，染色1h。染色完畢，傾出染色液，用水漂洗數(shù)遍凝膠，再加入脫色液（0.25mol/L KCl）。其間更換2～3次脫色液，直至凝膠的藍(lán)背景褪去、蛋白質(zhì)帶清晰為止［9－10］。

3.6 Western blotting

將SDS－PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的另一半凝膠用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將蛋白質(zhì)半干轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。將用轉(zhuǎn)膜緩沖液（2.9g/L glycine，5.8g/L Tris，0.37g/L SDS，20%甲醇）浸透的凝膠和濾紙按照由下而上按順序擺放（濾紙、PVDF膜、膠、濾紙），形成4層轉(zhuǎn)印體系，設(shè)置20V、1.0A、20min；用含有5%脫脂奶 粉 的 PBST 溶 液 （8g/L 的 NaCl，3.6g/L 的Na2HPO4·12H2O，0.24g/L 的 KH2PO4，0.2g/L的 KCl，0.1%的 Tween－20，pH 7.4）室溫封閉1h。一抗為兔抗GFP多克隆抗體，用含有5%脫脂奶粉的PBST按照1∶3 000稀釋。用稀釋后的一抗4℃孵育過夜后用PBST洗滌10min，重復(fù)3次。羊抗兔二抗用含有5%脫脂奶粉的PBST按照1∶5 000稀釋，室溫孵育1h。PBST洗滌10min，重復(fù)3次后，DAB法顯色。待清晰的條帶出現(xiàn)后，用dH2O洗膜2次。

3.7 膠內(nèi)酶切與質(zhì)譜鑒定

將SDS－PAGE凝膠上的GFP條帶切割到EP管內(nèi)，加入脫色液（25mmol/L的碳酸氫銨，50%的乙腈）；待條帶上的顏色脫干凈后，吸去脫色液，每孔加入100μL無水乙腈脫水30min后棄去乙腈；加入約10 ng胰蛋白酶（2.5ng/μL稀釋于25mmol/L碳酸氫銨中），4℃吸漲約45min，37℃酶解12～16h；加入100 μL含有0.1%TFA、50% 乙腈的萃取液，37℃搖床搖晃萃取肽段1h，使用抽干機(jī)抽干肽段13。肽段用10 μL、0.2%的甲酸溶解，使用 LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀進(jìn)行分析鑒定，納升液相以乙腈－0.1%甲酸為流動相，乙腈由0min的5%梯度升至30min的35%進(jìn)行肽段洗脫，流速為500nL/min。

4 結(jié)果

4.1 鎳柱親和純化GFP層析圖譜

將綠色熒光蛋白CDS序列連入到帶有6×His標(biāo)簽的載體上構(gòu)建pET28a－GFP表達(dá)載體，在原核大腸桿菌BL21中表達(dá)后使用鎳柱親和純化GFP蛋白。層析洗脫后有特異的親和洗脫峰流出，層析后得到的GFP蛋白有明顯的綠色熒光，表明得到了較純的GFP蛋白（見圖1）。

4.2 熒光光譜掃描分析圖譜，標(biāo)出吸收峰

GFP最大的特點(diǎn)是具有熒光發(fā)光基團(tuán)，熒光光譜分析表明，純化的GFP蛋白的最大激發(fā)波長480nm，最大發(fā)射波長500nm，與已知的GFP的熒光光譜基本相同（見圖2）。

圖1 原核表達(dá)GFP蛋白的層析圖譜

圖2 純化得到的GFP蛋白的熒光光譜掃描分析

4.3 利用電泳圖譜計(jì)算GFP的相對分子質(zhì)量

利用SDS－PAGE凝膠電泳對GFP蛋白進(jìn)行分離及考馬斯亮藍(lán)G－250染色，通過蛋白質(zhì)條帶觀察到親和純化GFP的效果好，并經(jīng)過計(jì)算得到GFP的相對分子質(zhì)量約為27kDa，與理論值吻合，見圖3（a）。

4.4 Western blotting免疫印跡圖譜

Western blotting免疫印跡實(shí)驗(yàn)通過蛋白轉(zhuǎn)印儀將GFP蛋白從SDS－PAGE凝膠上轉(zhuǎn)印到PVDF膜上后，經(jīng)過一抗和二抗反應(yīng)后，使用DAB方法對GFP條帶進(jìn)行顯色。結(jié)果表明，免疫印跡膜上具有很特異的GFP蛋白條帶，表明GFP蛋白的表達(dá)和純化成功，見圖3（b）。

4.5 GFP蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

質(zhì)譜鑒定實(shí)驗(yàn)通過將GFP蛋白條帶從SDSPAGE凝膠上切割下來，經(jīng)過脫色、脫水及胰蛋白酶酶切后得到肽段，使用LC－MS/MS質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定。結(jié)果表明，鑒定到19個(gè)GFP蛋白的肽段，序列覆蓋率為74.37%（見圖4）。

圖3 純化得到的GFP蛋白的SDS－PAGE電泳和免疫印跡結(jié)果

圖4 GFP蛋白的LC－MS/MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果

5 結(jié)論

（1）本實(shí)驗(yàn)從綠色熒光蛋白的原核蛋白表達(dá)、鎳柱親和純化到純化的GFP蛋白的免疫印跡和LCMS/MS質(zhì)譜鑒定，是學(xué)習(xí)蛋白表達(dá)、純化與鑒定的綜合性實(shí)驗(yàn)，內(nèi)容完整，是一個(gè)很好的綜合性實(shí)驗(yàn)。

（2）實(shí)驗(yàn)對象（綠色熒光蛋白）是生物學(xué)研究中的重要工具，實(shí)驗(yàn)過程中能加強(qiáng)學(xué)生對GFP發(fā)現(xiàn)發(fā)展的歷史及其在生物研究中的相關(guān)應(yīng)用的學(xué)習(xí)和理解。

（3）鎳柱親和純化蛋白質(zhì)、SDS－PAGE凝膠電泳及Western blotting免疫印跡實(shí)驗(yàn)是生物學(xué)研究中廣泛使用的重要實(shí)驗(yàn)技術(shù)，通過實(shí)驗(yàn)，能讓學(xué)生全面完整地掌握這些常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，學(xué)習(xí)各種生化儀器的使用。

（4）蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定是現(xiàn)代生物學(xué)研究中研究生物大分子的重要前沿技術(shù)。由于質(zhì)譜儀器昂貴，該實(shí)驗(yàn)的質(zhì)譜分析部分利用北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院質(zhì)譜測試平臺完成。該實(shí)驗(yàn)內(nèi)容屬于提高實(shí)驗(yàn)，使本科生有機(jī)會接觸到前沿的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，開拓學(xué)生的視野，提高參加科學(xué)研究的興趣。

該綜合實(shí)驗(yàn)適應(yīng)新形勢下實(shí)驗(yàn)教學(xué)的需要，在原有生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，密切結(jié)合當(dāng)前的生物學(xué)研究，并利用北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院特色科研平臺的優(yōu)勢，對現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行改革和創(chuàng)新，對于開展具有自我特色和創(chuàng)新的生物化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)具有重要意義。

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