劉鋒，鄭玲霞，徐兵，周紅升

(1.中國人民解放軍第171醫(yī)院血液科，江西九江 332000；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液科，廣東廣州 510515)

丙泊酚聯(lián)合氯胺酮麻醉對急性淋巴細(xì)胞白血病患兒外周血T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響

劉鋒1，鄭玲霞1，徐兵2，周紅升2

(1.中國人民解放軍第171醫(yī)院血液科，江西九江 332000；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液科，廣東廣州 510515)

目的觀察丙泊酚聯(lián)合氯胺酮麻醉對急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患兒外周血T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響。方法對照組為80例健康體檢兒童，試驗組為78例經(jīng)骨髓穿刺確診為ALL的患兒，試驗組患兒鞘內(nèi)注射化療藥物治療，期間靜脈注射丙泊酚[(2±1)mg/kg]聯(lián)合氯胺酮(0.5 mg/kg)鎮(zhèn)靜麻醉，分別將經(jīng)骨髓穿刺確診鎮(zhèn)靜麻醉前、鎮(zhèn)靜麻醉6 h后（即鞘內(nèi)注射前）及鎮(zhèn)靜麻醉24 h后(即鞘內(nèi)注射并鎮(zhèn)靜麻醉18 h后)的患兒血樣設(shè)為TG-t0組、TG-t1組和TG-t2組。采用流式細(xì)胞儀對外周血T淋巴細(xì)胞亞群：CD3、CD4、CD8和CD4/CD8的水平和CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞進(jìn)行檢測。以Ag-NORs、Th1/Th2比值及TGF-β作為免疫學(xué)指標(biāo)，采用KL型腫瘤免疫圖像分析系統(tǒng)對外周血Ag-NORs進(jìn)行檢測；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測Th1/Th2比值及TGF-β的血清濃度水平。結(jié)果試驗組患兒外周血CD8、Treg比例、TGF-β水平明顯高于對照組，而CD3、CD4、CD4/CD8比值、Ag-NORs水平及Th1/Th2比值明顯低于對照組，TG-t0組、TG-t1組和TG-t2組的T細(xì)胞亞群及相關(guān)免疫學(xué)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論ALL患兒較健康兒童機(jī)體免疫功能低下，而在診斷和術(shù)后使用丙泊酚聯(lián)合氯胺酮麻醉對其外周血T淋巴細(xì)胞免疫功能改變無直接影響。

急性淋巴細(xì)胞白血??；丙泊酚，氯胺酮；T淋巴細(xì)胞；免疫功能；鞘內(nèi)注射

急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患兒常伴有細(xì)胞免疫功能受損，表現(xiàn)為T細(xì)胞亞群比例紊亂和功能受損；具有免疫抑制作用的CD4+CD25+Treg細(xì)胞及其與瘤細(xì)胞共同分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等免疫抑制因子的高表達(dá)；輔助T淋巴細(xì)胞1型/2型(Th1/ Th2)比例失衡等。ALL目前仍以綜合治療為主，而化療在其治療中占有重要地位，采用鞘內(nèi)注射是目前治療ALL的一個重要手段。ALL患兒在診斷和化療過程中常要進(jìn)行鎮(zhèn)靜治療。麻醉和手術(shù)可能對ALL患兒的細(xì)胞免疫功能有一定影響，研究表明，麻醉藥品可能影響實體瘤與癌癥細(xì)胞增殖[1-2]。本研究旨在探討丙泊酚聯(lián)合氯胺酮麻醉對早期ALL患兒診斷和鞘內(nèi)注射化療后對其外周血T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究試驗組為2012年1月至2013年6月在解放軍第171醫(yī)院和南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院住院的78例患兒，經(jīng)骨髓穿刺確診為急性淋巴細(xì)胞白血病。其中男性44例，女性34例，年齡2～15歲，平均(6.27±3.84)歲。對照組為80例同期來兩醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的健康兒童，其中男性42例，女性38例，年齡2～15歲，平均(6.18±3.73)歲。所有病例均符合兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的診療建議標(biāo)準(zhǔn)[3]；均無腫瘤及自身免疫疾病史；3周內(nèi)均未接種過疫苗；1周內(nèi)均未進(jìn)行過手術(shù)治療。

1.2 治療分組本研究分為試驗組和對照組，按照醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的基本倫理原則，本研究中暫無骨髓穿刺診斷和鞘內(nèi)注射化療藥物后未經(jīng)鎮(zhèn)靜麻醉的對照組，因此試驗設(shè)計采用自身前后對照[4]以研究丙泊酚聯(lián)合氯胺酮麻醉對早期ALL患兒診斷和鞘內(nèi)注射化療后外周血T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響，并設(shè)對照組以研究早期初診ALL患兒外周血T淋巴細(xì)胞免疫功能的改變。分別將經(jīng)骨髓穿刺確診后患兒，經(jīng)靜脈注射丙泊酚[(2±1)mg/kg]聯(lián)合氯胺酮(0.5 mg/kg)鎮(zhèn)靜麻醉前、鎮(zhèn)靜麻醉6 h后(即鞘內(nèi)注射前)及鎮(zhèn)靜麻醉24 h后(即鞘內(nèi)注射并鎮(zhèn)靜麻醉18 h后)的患兒血樣設(shè)為TG-t0組、TG-t1組和TG-t2組[4]，如圖1所示。

圖1 試驗組分組方案

1.3 治療方法鞘內(nèi)注射化療藥物為0.9%生理鹽水(NS)10 ml+甲氨蝶呤(MTX)10 mg+阿糖胞苷(Ara-C)50 mg+地塞米松(DXMS)5 mg，針對MTX耐藥或嚴(yán)重頭痛等的不良反應(yīng)者，也可用阿糖胞苷(Ara-C)50 mg代替。對照組兒童在性別、年齡構(gòu)成上與試驗組患兒相匹配。

1.4 主要試劑與材料抗CD3、CD4、CD8單抗及CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Alexa Fluro 647單克隆抗體及其同型對照抗體等購自美國BD公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購置美國GIBCO公司；小牛血清購自廣州蕊特生物科技有限公司；FASC溶血素和流式細(xì)胞儀均購自美國BD公司；KL型腫瘤免疫圖像分析系統(tǒng)購自北京健爾康醫(yī)療設(shè)備有限公司；ELISA試劑盒購自美國eBioScience公司。

1.5 T細(xì)胞亞群的檢測分別采集對照組和試驗組兒童空腹下外周血，經(jīng)肝素抗凝，密度梯度離心法分離得單個核細(xì)胞(MNC)，用2 mmol/L的谷氨酰胺和含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)成終濃度為1×106/ml后將抗CD3、CD4、CD8單抗加入至100 μl的MNC中，室溫避光孵育30 min，PBS洗2次，用500 μl的2%多聚甲醛固定后避光靜置30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.7 免疫學(xué)指標(biāo)的檢測

1.7.1 T淋巴細(xì)胞核仁組成區(qū)嗜銀蛋白(Ag-NORs)的檢測無菌條件下分別采集對照組和試驗組兒童空腹下外周血，肝素抗凝，取抗凝血500 μl加入到含RPMI-1640培養(yǎng)液中37℃下培養(yǎng)72 h后，取10 ml細(xì)胞懸液經(jīng)離心10min后棄去上清液，加入5 ml低滲液混勻后再加入0.5 ml固定液混勻，離心棄上清，重復(fù)操作一遍。沉淀中再加入0.3 ml固定液，混勻后取2滴至預(yù)冷載玻片上，過火晾干，然后放于預(yù)熱后的鋁板上，去熱后加入4滴染液A和2滴染液B，將蓋玻片輕放于載玻片上，待其為深黃色時取下，凈水洗凈后自然晾干，將染片置顯微鏡載物臺上，經(jīng)KL型腫瘤免疫圖像分析系統(tǒng)計數(shù)30個淋巴細(xì)胞銀染核仁區(qū)面積與核面積的比值(IS%)。

1.7.2 Th1/Th2及TGF-β的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，利用定量ELISA試劑盒測定對照組和試驗組兒童空腹下外周血血清中Th1/Th2比值(其中INF-γ代表Th1，IL-10代表Th2)和TGF-β的含量(根據(jù)試劑盒中樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線計算)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用大樣本均值間的u檢驗對對照組和試驗組間樣本差異進(jìn)行顯著性檢驗，以配對資料的u檢驗對TG-t0組、TG-t1組和TG-t2組間樣本差異進(jìn)行顯著性檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組與試驗組的臨床特征比較對照組和試驗組(鎮(zhèn)靜麻醉前初診患兒)年齡、體重、C反應(yīng)蛋白、血紅蛋白、白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)等臨床特征見表1。與對照組比較，急性淋巴細(xì)胞白血病患兒有白細(xì)胞數(shù)增高伴不同程度的血小板減少等血象特征。

表1 對照組與試驗組的臨床特征比較(±s)

表1 對照組與試驗組的臨床特征比較(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.01。

組別對照組試驗組年齡(歲) 6.18±3.73 6.27±3.84性別比(男/女) 42/38 44/34體重(kg) 24.27±4.17 24.31±3.24血紅蛋白(g/L) 113.45±11.04 63.14±12.36a白細(xì)胞數(shù)(109/L) 7.21±3.15 67.21±68.35a血小板數(shù)(109/L) 138.57±16.28 64.51±31.83aC反應(yīng)蛋白(mg/L) 7.27±2.53 43.58±37.94a原始淋巴細(xì)胞+幼稚淋巴細(xì)胞(%) 7.13±1.48 57.46±12.71a

2.2 外周血T細(xì)胞亞群的變化比較與對照組比較，試驗組患兒外周血T細(xì)胞亞群明顯異常，表現(xiàn)為外周血抑制性T細(xì)胞(CD8)明顯高于對照組，而總T細(xì)胞(CD3)、輔助性T細(xì)胞(CD4)及CD4/CD8比值則明顯低于對照組。所有患兒TG-t0組、TG-t1組和TG-t2組的CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 外周血T細(xì)胞亞群變化比較(±s)

表2 外周血T細(xì)胞亞群變化比較(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05。

項目對照組TG-t0組TG-t1組TG-t2組CD3(%) CD4(%) CD8(%) CD4/CD868.52±3.67 40.71±3.82 25.95±6.84 1.48±0.27 47.53±6.25a26.38±4.97a35.62±7.71a0.74±0.24a47.45±6.31a26.41±4.85a35.15±7.53a0.72±0.18a46.79±6.27a26.12±4.74a35.46±7.17a0.71±0.31a

2.4 免疫學(xué)指標(biāo)的變化比較與對照組比較，試驗組患兒血清中Ag-NORs、Th1/Th2比值均明顯低于對照組，而血清TGF-β水平均較對照組明顯升高。所有患兒血清中Ag-NORs、Th1/Th2比值及TGF-β水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 免疫學(xué)指標(biāo)變化比較(±s)

表3 免疫學(xué)指標(biāo)變化比較(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05。

組別TGF-β(ng/ml) Ag-NORs(IS%)Th1/Th2對照組TG-t0組TG-t1組TG-t2組1.06±0.38 1.28±0.47a1.31±0.52a1.30±0.49a8.66±0.78 5.91±0.74a5.87±0.68a5.89±0.72a1.24±0.32 1.08±0.38a1.06±0.34a1.05±0.37a

3 討論

急性淋巴細(xì)胞白血病為一種骨髓惡性細(xì)胞惡性克隆性疾病，其前體淋巴細(xì)胞增值代替了骨髓的正常造血功能。鞘內(nèi)注射化療藥物是ALL治療的重要手段，但長時間手術(shù)應(yīng)激往往會降低患者的免疫功能，導(dǎo)致術(shù)后感染和增加病情風(fēng)險[6]。麻醉能減少術(shù)后引起的應(yīng)激反應(yīng)，但不同麻醉方法與麻醉藥品本身可能會對患者的免疫功能造成影響，一定程度上影響ALL患者的治療與預(yù)后，因此，麻醉對ALL患兒的免疫功能的影響不容忽視。異丙酚為臨床上最常使用的靜脈全麻藥，關(guān)于異丙酚對機(jī)體免疫功能的影響已進(jìn)行了大量的研究，認(rèn)為異丙酚比吸入麻醉藥更能保護(hù)機(jī)體免疫功能[7]。有學(xué)者關(guān)于異丙酚和異氟醚對手術(shù)引起的免疫應(yīng)答的影響研究表明，異丙酚能更好地減輕手術(shù)引起的應(yīng)激反應(yīng)[8-9]。氯胺酮為臨床常用靜脈全麻藥，臨床亞劑量的氯胺酮具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)靜作用。Beilin等[10]的研究表明，麻醉誘導(dǎo)前靜注小劑量氯胺酮，IL-2保持術(shù)前水平而IL-6與TNF-α分泌減少，有利于患者圍術(shù)期免疫調(diào)節(jié)平衡。然而未見關(guān)于丙泊酚聯(lián)合氯胺酮麻醉對ALL患兒診斷和鞘內(nèi)注射化療后是否有細(xì)胞免疫功能影響的報道。本文旨在研究急性淋巴細(xì)胞白血病患兒外周血T淋巴細(xì)胞免疫功能，以了解其免疫狀態(tài)，并觀察診斷和術(shù)后使用丙泊酚聯(lián)合氯胺酮麻醉對其外周血T細(xì)胞亞群及細(xì)胞免疫功能的影響。

ALL的發(fā)生、發(fā)展與多種因素有關(guān)，當(dāng)機(jī)體免疫功能紊亂或低下時，ALL的發(fā)病率增高。T淋巴細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及其治療中發(fā)揮重要作用，其中CD4+細(xì)胞主要為輔助性T細(xì)胞(Th)，可分為Th1、Th2、Th17三類效應(yīng)細(xì)胞；而細(xì)胞主要由細(xì)胞毒性和抑制性T細(xì)胞組成。本研究結(jié)果表明，試驗組患兒外周血T細(xì)胞亞群較對照組明顯異常，表現(xiàn)為CD8明顯高于對照組而CD3、CD4及CD4/CD8比值則明顯低于對照組，與已有文獻(xiàn)報道一致[11]，而所有患兒在診斷和術(shù)后使用丙泊酚聯(lián)合氯胺酮麻醉對其外周血CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值影響均差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

為進(jìn)一步比較丙泊酚聯(lián)合氯胺酮麻醉對ALL患兒細(xì)胞免疫功能的影響，選擇以下指標(biāo)進(jìn)行檢測[15]：(1)Ag-NORs(2)Th1/Th2比值(3)TGF-β。Ag-NORs為RNA聚合酶亞單位，其表達(dá)水平與機(jī)體腫瘤生長狀況密切相關(guān)，可作為腫瘤診斷和病情檢測的重要指標(biāo)，其含量減少表明機(jī)體的免疫功能降低。Th1/Th2兩類細(xì)胞因子平衡失調(diào)是導(dǎo)致許多疾病免疫功能低下的基礎(chǔ)，Th1細(xì)胞選擇性產(chǎn)生促炎癥因子，如IL-1和INF-γ，而Th2細(xì)胞選擇性產(chǎn)生抗炎癥因子，如IL-4和IL-10，Th1/Th2比值可反映機(jī)體抗腫瘤狀態(tài)，Th1向Th2偏移則導(dǎo)致免疫抑制狀態(tài)。而TGF-β能反映腫瘤對機(jī)體免疫應(yīng)答的抑制程度。研究表明，試驗組患兒的Ag-NORs和Th1/Th2比值較對照組均顯著降低，而TGF-β水平顯著升高，與文獻(xiàn)報道一致[15]。同時所有患兒在診斷和術(shù)后使用丙泊酚聯(lián)合氯胺酮麻醉對其外周血各項免疫學(xué)指標(biāo)影響差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，細(xì)胞免疫紊亂是導(dǎo)致ALL發(fā)生與病情發(fā)展的重要原因和嚴(yán)重后果，該研究表明ALL患兒機(jī)體免疫功能低下，而在診斷和術(shù)后使用丙泊酚聯(lián)合氯胺酮麻醉對其外周血T淋巴細(xì)胞免疫功能無直接影響。因而提示，丙泊酚聯(lián)合氯胺酮麻醉是ALL患兒化療手術(shù)中一種較理想的麻醉方法。

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Effects of propofol combined with ketamin on the changes in immune function of T lymphocytes in peripheral blood from children with acute lymphocytic leukemia.

LIU Feng1,ZHENG Ling-xia1,XU Bing2,ZHOU Hong-sheng2.1.Department of Hematology,the 171stHospital of Chinese PLA,Jiujiang 332000,Jiangxi,CHINA;2. Department of Hematology,Nanfang Hospital of Southern Medical University,Guangzhou 510515,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of propofol combined with ketamin on the changes in immune function of T lymphocytes in peripheral blood from children with acute lymphocytic leukemia(ALL).MethodsA total of 80 healthy children were selected as the control group,while 78 children with ALL diagnosed by bone marrow aspiration were enrolled as the study group.Patients in the study group undergoing lumber puncture with chemotherapeutics received sedation with IV propofol[(2±1)mg/kg]and ketamine(0.5 mg/kg).Blood samples of patients before sedation for bone marrow aspiration was represented as TG-t0,sedation 6 hours after TG-t0(before lumber puncture with chemotherapeutics)was represented as TG-t1,and 24 hours after TG-t0(during lumber puncture with chemotherapeutics sedation 18 hours)was represented as TG-t2.Levels of T lymphocyte subsets and CD4+CD25+CD127-Treg cells were detected by flow cytometry.The ratio of Ag-NORs,Th1/Th2 and TGF-β were used as cellular immune indicators.A KL image system was used to analyze the ratio of Ag-NORs of T lymphocytes,and ELISA assay was employed to investigate the Th1/Th2 and levels of TGF-β in serum.ResultsThe proportion of CD8 cells and Treg cells and levels of TGF-β in serum from patients in the study group were higher than those of the control group.There were no significant differences in the levels of T lymphocyte subsets and cellular immune indicators among group TG-t0, group TG-t1 and group TG-t2.ConclusionChildren withALL have lower immune function,and sedation with propofol-ketamine combination may not affect the immune function of T lymphocytes in peripheral blood directly.

Acute lymphocytic leukemia;Propofol;Ketamin;T lymphocyte;Immune function;Lumber puncture

R733.71

A

1003—6350（2014）05—0693—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.05.0269

2013-08-09)

劉鋒。E-mail：liufeng171126@126.com