董小林，張少君，邱桂華，廖雪梅，楊潔

（湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院健康體檢中心，湖北十堰 442000）

BAALC蛋白在急性白血病中的表達及其臨床意義

董小林，張少君，邱桂華，廖雪梅，楊潔

（湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院健康體檢中心，湖北十堰 442000）

目的探討腦和急性白血病胞質(zhì)(Brain and acute leukemia cytoplasmic，BAALC)蛋白在急性髓細胞性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)的表達及其臨床意義。方法采用Western blot方法半定量檢測BAALC蛋白在58例AML患者(初診24例、完全緩解28例和復發(fā)6例)的骨髓單個核細胞(Bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs)的表達水平，15例非惡性血液病患者以及AML細胞系KG1α和HL-60分別作為陰性和陽性對照。結(jié)果KG1α和HL-60細胞BAALC均為陽性高表達，非惡性血液病對照者BAALC表達均為陰性。BAALC陽性率在AML初診組(83.3%)與復發(fā)組(100%)均高于完全緩解(CR)組(7.1%)和陰性對照組(0)(P＜0.001)；AML初診組和復發(fā)組的BAALC蛋白相對含量明顯高于CR組和陰性對照組(P＜0.01)，且CR組和陰性對照組之間BAALC表達陽性率和相對含量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結(jié)論BAALC蛋白在AML中表達水平異常增高，提示BAALC可能與AML的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

急性髓系白血?。籅AALC；完全緩解

腦和急性白血病胞質(zhì)(Brain and acute leukemia cytoplasmic，BAALC)基因定位于人類染色體8q22.3，最初是在伴有8號染色體三體的AML中鑒定出來的[1]。正常情況下，BAALC基因主要表達在神經(jīng)組織(如：腦、脊索)和神經(jīng)外胚層來源組織(如腎上腺、甲狀腺、脾臟)及造血前體細胞如CD34+的早期造血細胞[2]，編碼的蛋白質(zhì)在高等哺乳動物中的表達高度保守。近年來研究發(fā)現(xiàn)，BAALC mRNA在急性髓系白血病高表達，與AML患者的預后切相關(guān)，被認為是AML預后較差的指標之一[3-6]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)BAALC基因編碼的蛋白與目前已知的蛋白有同源性，且BAALC蛋白在AML中的表達研究較少，功能尚不明確。我們采用Western blot方法半定量檢測了AML細胞系KG1α和HL-60以及58例AML患者骨髓單個核細胞(Bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs)中的BAALC蛋白表達，并收集了AML患者的臨床資料，追蹤觀察臨床療效，并了解不同病情(初診、完全緩解、復發(fā))AML患者BAALC的表達水平，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料病例來自2010年3月至2012年8月期間我院血液科住院或者門診隨訪AML患者58例，男性33例，女性25例，中位年齡45歲(21～69歲)。AML的診斷、完全緩解、復發(fā)標準按張之南主編《血液病診斷及療效標準》[7]，其中初診24例(M02例，M29例，M32例，M511例)，完全緩解(CR)28例(M28例，M38例，M510例)和復發(fā)6例(M01例，M23例，M52例)。初診的AML患者接受誘導緩解治療，包括DA(柔紅霉素+阿糖胞苷)、IA(去甲柔紅霉素+阿糖胞苷)、NV(米托蒽醌+衛(wèi)萌)等化療方案，M3首選全反式維甲酸+DA。獲得CR的患者隨后給予鞏固治療、維持治療或進行造血干細胞移植。非惡性血液病患者15例作為陰性對照，其中巨幼細胞性貧血3例，缺鐵性貧血(IDA)6例，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)6例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑人淋巴細胞分離液(Ficoll，北京西美杰科技有限公司)，PIPAⅠ型全蛋白抽提試劑盒(美國DBI Bioscience)，BCA蛋白含量檢測試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)，兔抗人BAALC多克隆抗體(美國Abcam)，β-actin抗體和二抗(HRP標記羊抗兔IgG)(美國Santa Cruz)，PVDF蛋白印記膜(美國MilliPore)，ECL化學發(fā)光試劑盒(美國Pierce)。

1.2.2 AML細胞系與細胞培養(yǎng)KG1α細胞和HL-60細胞購自中科院上海細胞庫。HL-60細胞和KG1α細胞分別接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代，取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗，作為本研究的陽性對照組。

1.2.3 標本采集及單個核細胞分離抽取骨髓液2～5 ml，用肝素抗凝，以磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后加入人淋巴細胞分離液(Ficoll)上，離心20 min，分離得到單個核細胞，PBS洗滌兩次，細胞沉淀于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Western blot檢測按照RIPA全蛋白抽提試劑盒的說明提取細胞總蛋白，用BCA蛋白含量檢測試劑盒進行蛋白定量。以每孔40 μg上樣，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA室溫封閉1 h。BAALC抗體(1:1 200)4℃孵育過夜，以β-actin抗體(1:2 000)為內(nèi)參照，二抗IgG-HRP(1:4 000)室溫孵育1 h，TBST振蕩洗滌，加入ECL發(fā)光液顯色曝光。實驗重復3次。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析BAALC與β-actin的灰度比值代表BAALC蛋白的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，組間均數(shù)的比較采用LSD檢驗，率的比較采用Pearson Chi-Square(χ2)檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BAALC蛋白在非惡性血液病對照者和AML細胞系中的表達15例非惡性血液病對照者BAALC蛋白BAALC相對含量為(0.041±0.032)，均為陰性。在KG1α和HL-60白血病細胞株中BAALC均為高表達，BAALC相對半定量值(BAALC/β-actin灰度比)分別為(3.247±0.640)和(1.842±0.385)(n=3，圖1A)。根據(jù)陽性對照組、陰性對照組以及實驗組中BAALC蛋白表達水平，該實驗中選定BAALC/β-actin灰度比值≥0.1為高表達，＜0.1為低表達，以此計算BAALC表達的陽性率。

2.2 AML患者BAALC蛋白的表達AML患者BAALC蛋白表達陽性率在初診組(83.3%)和復發(fā)組(100%)均高于CR組(7.1%)和陰性對照組(0)(P＜0.001)，CR組和陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義(χ2值= 0.09，P=0.764)。采用Pearson Chi-Square(χ2)檢驗比較不同組間BAALC蛋白的表達水平，CR組與陰性組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.122)，而初診組和復發(fā)組BAALC蛋白明顯低于CR組和陰性對照組(P＜0.05)。有3例AML患者在疾病的不同時期檢測出BAALC的高表達：1例M5患者BAALC/β-actin初診時為1.353，CR時為3.329，且隨訪該患者CR后4個月復發(fā)；1例M2a患者初診時為2.629，經(jīng)化療達完全緩解后，BAALC表達量將至0.173；另1例M2患者CR時為0.087，復發(fā)時為1.376(圖1B)。

圖1 BAALC在AML患者和細胞系中的表達情況

3 討論

白血病的發(fā)生和發(fā)展與多種相關(guān)致癌基因過表達或(和)抑癌基因失活有關(guān)，其中某些基因的異常表達起關(guān)鍵作用。BAALC基因是近年來研究發(fā)現(xiàn)的與AML的發(fā)生和預后有密切關(guān)聯(lián)的重要基因之一。BAALC基因最初發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)外胚層來源的組織中表達，隨后研究發(fā)現(xiàn)來自骨髓的CD34+祖細胞也表達BAALC mRNA，在骨髓祖細胞分化過程中，BAALC的表達水平不斷下調(diào)[8-9]，而且BAALC基因主要表達于這兩種組織和細胞。Tanner等[1]研究發(fā)現(xiàn)AML、ALL及CML急變期患者可檢測到BAALC基因的高表達，而CML慢性期患者及CLL患者則檢測不到。國內(nèi)研究者采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測到正常成人骨髓中也存在BAALC mRNA的低表達[10]。研究表明，BAALC mRNA在新診斷的正常核型AML高表達，與完全緩解失敗、原發(fā)性耐藥和明顯短的總生存和高的復發(fā)率有關(guān)[11-12]，被認為是AML患者的預后不良指標。也有研究報道在成人前體B細胞ALL患者中，BAALC基因過表達的患者也具有較差的總生存率[13-14]。前述研究主要集中于研究BAALC基因mRNA表達水平與AML的預后關(guān)系，而BAALC蛋白在AML發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用尚不清楚。

我們用Western blot方法檢測了BAALC蛋白在KG1α和HL-60白血病細胞系、AML患者以及非惡性血液病患者對照BM-MNCs中的表達。結(jié)果表明，BAALC蛋白在KG1α和HL-60細胞均呈高表達，在非惡性血液病對照組表達極低甚至不能測出，而在AML患者初診、完全緩解和復發(fā)不同病情時表達程度差異較大，初診和復發(fā)患者BAALC蛋白明顯高于完全緩解患者和非惡性血液病患者，且完全緩解和非惡性血液病患者之間表達差異無統(tǒng)計學意義。本研究中發(fā)現(xiàn)，1例AML患者BAALC在初診時BAALC表達已有升高，復發(fā)時BAALC表達進一步升高；另1例AML患者初診時BAALC表達升高，經(jīng)治療達CR后BAALC表達下降。

BAALC蛋白的功能研究報道較少。有研究者成功構(gòu)建BAALC基因的表達載體分別轉(zhuǎn)染人HL60/ADM、MOLT-4和K562細胞株篩選得到穩(wěn)定過表達該基因細胞系，發(fā)現(xiàn)BAALC基因能促進HL60/ADM細胞株的增殖、抑制凋亡及增加HL60/ADM細胞株拮抗As203誘導凋亡的能力[15]。BAALC基因沉默后能抑制KG1α細胞的增殖和誘導細胞凋亡[16]。表明BAALC基因可能在AML的發(fā)生發(fā)展過程中起促進作用。

綜上所述，BAALC在AML的發(fā)生、進展及演變過程中可能發(fā)揮了重要作用，從而有可能成為AML治療的新靶點。

[1]Tanner SM,Austin JL,Leone G,et al.BAALC,the human member of a novel mammalian neuroectoderm gene lineage,is implicated in hematopoiesis and acute leukemia[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98(3):13901-13906.

[2]Baldus CD,Tanner SM,Kusewitt DF,et al.BAALC,a novel marker of human hematopoietic progenitor cells[J].Exp Hematol,2003, 31(11):1051-1056.

[3]Baldus CD,Tanner SM,Ruppert AS,et al.BAALC expression predicts clinical outcome of de novo acute myeloid leukemia patients with normal cytogenetics:a Cancer and Leukemia Group B Study [J].Blood,2003,102(5):1613-1618.

[4]Bienz M,Ludwig M,Leibundgut EO,et al.Risk assessment in patients with acute myeloid leukemia and a normal karyotype[J].Clin Cancer Res,2005,11(4):1416-1424.

[5]Baldus CD,Thiede C,Soucek S,et al.BAALC expression and FLT3 internal tandem duplication mutations in acute myeloid leukemia patients with normal cytogenetics:prognostic implications[J].J Clin Oncol,2006,24(5):790-797.

[6]Haferlach C,Kern W,Schindela S,et al.Gene expression of BAALC, CDKN1B,ERG,and MN1 adds independent prognostic information to cytogenetics and molecular mutations in adult acute myeloid leukemia[J].Genes,Chromosomes Cancer,2012,51(3):257-265.

[7]張之南,沈悌.血液病診斷及療效標準[M].3版.北京:科學出版社,2007:103-134.

[8]Baldus CD,Komor M,Hoelzer D,et al.Significant down-Regulation of BAALC during lineage specific hematopoietic differentiation[J].Blood,2004,104(11):133.

[9]Mrozek K,Bloomfield CD.Chromosome aberrations,gene mutations and expression changes,and prognosis in adult acute myeloid leukemia[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2006,2(8):169-177.

[10]李紅藝,魏旭東,呂曉東.實時熒光定量PCR檢測BMLC基因在正常核型急性髓系白血病中的表達[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2008, 18(12):1706-1709.

[11]Santamaria C,Chillon MC,Garcia-Sanz R,et al.BAALC is an important predictor of refractoriness to chemotherapy and poor survival in intermediate-risk acute myeloid leukemia(AML)[J].Ann Hematol,2010,89(5):453-458.

[12]徐兵,宋小燕,唐家宏,等.熒光定量PCR檢測急性髓細胞白血病患者BAALC基因及臨床意義[J].中國檢驗醫(yī)學雜志,2007,30 (10):1123-1126.

[13]KuhnlA,Gokbuget N,StrouxA,et al.High BAALC expression predicts chemoresistance in adult B-precursor acute lymphoblastic leukemia[J].Blood,2010,115(18):3737-3744.

[14]Baldus CD,Martus P,Burmeister T,et al.Low ERG and BAALC expression identifies a new subgroup of adult acute T-lymphoblastic leukemia with a highly favorable outcome[J].J Clin Oncol, 2007,25(24):3739-3745.

[15]蕭平難,宋曉燕,徐兵,等.穩(wěn)定過表達BAALC基因人白血病細胞株建立及生物學活性研究[J].廣東醫(yī)學,2011,38(14): 1441-1449.

[16]Xu B,Chen G,Shi P,et al.shRNA-mediated BAALC knockdown affects proliferation and apoptosis in human acute myeloid leukemia cells[J].Hematology,2012,17(1):35-40.

Expression significance of BAALC in acute myeloid leukemia.

DONG Xiao-lin,ZHANG Shao-jun,QIU Gui-hua, LIAO Xue-mei,YANG Jie.Physical Examination Center,People's Hospital Affiliated to Hubei Medicine College,Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression and its significance of brain and acute leukemia cytoplasmic(BAALC)in acute myeilod leukemia(AML).MethodsBAALC level was assessed by Western blot in the bone marrow mononuclear cells(BM-MNCs)of 58 AML patients,including 24 newly diagnosed patients,28 complete remission patients and 6 relapsing patients,15 nonmalignant hematopathy patients as negative controls and AML cell line KG1α and HL-60 as positive controls.ResultsThe expression of BAALC was positive in KG1α and HL-60 cells but negative in 15 negative controls.The BAALC positive rate in AML newly diagnosed group(83.3%) and relapsing group(100%)was higher than that in complete remission(CR)group(7.1%)and negative control group (P＜0.001).BAALC relative amount in AML newly diagnosed group and relapse group was significantly higher than that in CR group and negative control group(P＜0.01).The positive rate and relative amount of BAALC showed no statistically difference between CR group and negative controls.ConclusionBAALC is overexpressed in AML patients,suggesting that BAALC is associated with the development ofAML.

Acute myeloid leukemia;BAALC;Complete remission

R733.71

A

1003—6350(2014)05—0639—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.05.0250

2013-05-28)

楊潔。E-mail：146653354@qq.com