張艷林，牛玉生

（1.廣東環(huán)境保護(hù)工程職業(yè)學(xué)院　環(huán)境監(jiān)測系，廣東　佛山　528216；2.青島大學(xué)，山東　青島　266071）

功能化磁性納米粒子增強電化學(xué)發(fā)光檢測的研究

張艷林1，牛玉生2

（1.廣東環(huán)境保護(hù)工程職業(yè)學(xué)院環(huán)境監(jiān)測系，廣東佛山528216；2.青島大學(xué)，山東青島266071）

摘要：考察了五種不同功能化磁性納米粒子對?/TPA體系電化學(xué)發(fā)光（ECL）強度的影響，并對其中能顯著增強?ECL強度的磁性納米粒子的使用條件進(jìn)行了初步的優(yōu)化。通過電化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)BG-Fe、BPG-Fe、PAA-Fe、PE-Fe四種磁性粒子可增強/TPA體系的ECL強度，增強幅度依次為30%、13%、73%、42%；COOH-MNPs磁性粒子可淬滅該體系的ECL強度，淬滅幅度為23.2%。實驗結(jié)果表明，濃度為7μg/mL的PAA-Fe磁性納米粒子經(jīng)磁鐵富集，在電極上富集5min是其促進(jìn)ECL強度增強的最優(yōu)條件。本研究對基于功能化磁性納米粒子開發(fā)新的電化學(xué)發(fā)光試劑和建立新的電化學(xué)發(fā)光體系具有重要意義。

關(guān)鍵詞：電化學(xué)發(fā)光；磁性納米粒子；電化學(xué)發(fā)光試

1　引言

電化學(xué)發(fā)光（Electrochem icaluminescence，ECL）技術(shù)由于具有背景噪音低，靈敏度高、所用儀器簡單、易精確控制和自動化等優(yōu)點，已經(jīng)成為分析科學(xué)中一種重要而有價值的研究方法［1]。磁性微納米材料作為一種新型的功能材料，因特殊的磁導(dǎo)向性、超順磁性，其表面可連接生物活性功能基團等特點，其與ECL技術(shù)聯(lián)用，可以增強電化學(xué)發(fā)光強度和靈敏度，為ECL技術(shù)研究開辟了一個廣闊的空間，如磁性納米材料結(jié)合ECL技術(shù)已實現(xiàn)了炭疽孢子、血小板衍生生長因子β鏈二聚體和Ramos腫瘤細(xì)胞的檢測［2-4]。近年來，發(fā)展新的電化學(xué)發(fā)光試劑和建立新的電化學(xué)發(fā)光體系，已成為電化學(xué)發(fā)光研究的熱點，本文以BG-Fe、BPG-Fe、PAA-Fe、PE-Fe和COOH-MNPs五種不同功能化磁性納米粒子為研究對象，尋找一種能顯著增強Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度的最優(yōu)功能化磁性納米粒子，以期降低電化學(xué)發(fā)光檢測中被檢測物的最低檢測限，為電化學(xué)發(fā)光廣泛應(yīng)用于物質(zhì)檢測提供參考。

2　實驗部分

2.1儀器、試劑及供試材料

CHI800電化學(xué)工作站；MPI-A型毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測儀（西安邁瑞分析儀器有限公司），檢測池采用特制的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測池。

分析純Ru（bpy）3Cl2·6H2O、三丙胺（TPA）（美國Sigma-Aldrich公司）。支持電解質(zhì)為100mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4溶液（pH=7.4），配制溶液所用水均經(jīng)Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）純化。

供試功能化磁性納米材料主要包括：（1）BG-Fe：BPEI保護(hù)Graphene（石墨烯）+COOH-Fe3O4（30nm）；（2）BPG-Fe：BPEI保護(hù)Graphene+聚苯胺+COOH-Fe3O4（30nm）；（3）PAA-Fe：PAA-Graphene+Fe3O4；（4）PE-Fe：BPEI-Graphene+Fe3O4；（5）COOH-MNPs。其中BPEI為聚乙烯亞胺，PAA為聚丙烯酸。

空白液和對比液的配制：空白液含10μMu（bpy）2+3、1mMTPA、100mMPBS溶液；對比液分別為含有5μg/mL（磁微球聚合物中Fe3O4的濃度）的5種不同的功能化磁性納米粒子。

2.2實驗步驟

2.2.1電極制備

工作電極采用特制磁鐵可拆卸的金電極，使用前需經(jīng)砂紙小心打磨，然后依次用1.0和0.3μm粒徑的氧化鋁粉末打磨，直至呈光滑鏡面后超聲清洗。

參比電極為3cm長的銀絲，一端焊接銅絲作為導(dǎo)線。用砂紙擦拭銀絲部分后浸入到3M硝酸溶液中去除銀絲表面的氧化層。5分鐘后取出，沖洗晾干后置于0.1MHCl溶液中電鍍（室溫，電流為20μA，電鍍時間24h）。等銀絲表面均勻覆蓋上一層黑灰色的AgCl層后，把制備好的Ag/AgCl參比電極插入到一個充滿飽和KCl溶液的玻璃管中，玻璃管底部用一根直徑為100μm的鉑絲穿孔便于電子傳遞。

三電極體系的對電極采用一段長度約為4cm的鉑絲。

2.2.2磁性材料預(yù)處理

將制備好的各種磁性納米材料經(jīng)離心富集。取1mL磁性材料，加1mL乙醇后離心（5000rpm，5min）重復(fù)5次，再用超純水離心清洗5次，以去除其中的各種聚合物及未轉(zhuǎn)化的FeCl3，最后上清液在磁鐵吸附條件下去除。

2.2.3測定方法

金電極每次在使用前分別用1μm和0.3μm三氧化二鋁粉拋光，在二次水中充分超聲洗滌后，然后在0.1M的H2SO4溶液中用CHI800電化學(xué)分析儀在-0.2V-1.6V的電位區(qū)間內(nèi)循環(huán)掃描，直到三個金電極特征峰顯現(xiàn)并電流穩(wěn)定，取出電極后用二次水清洗和氮氣吹干。在磁鐵吸附電極的情況下，分別對空白液以及對比液進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描和檢測ECL強度。測試參數(shù)為：放大級數(shù)為3倍，光電倍增管電壓為800V，采樣時間：10T/S。

2.2.4條件優(yōu)化

2.2.4.1磁極方向的影響

取5μg/mL可顯著增強Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度的最優(yōu)功能化磁性納米粒子在空白液中經(jīng)磁鐵正反兩面富集后，觀察磁性納米粒子的發(fā)光情況。

2.2.4.2富集時間的影響

取5μg/mL可顯著增強Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度的最優(yōu)功能化磁性納米粒子在空白液中經(jīng)電極依次富集5min、20min、30min后，

觀察磁性納米粒子ECL強度的變化情況。

2.2.4.3磁微球濃度的影響

檢測可顯著增強Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度的最優(yōu)功能化磁性納米粒子在1、2、5、7、10μg/mL不同濃度下的ECL強度。

3　實驗結(jié)果

3.1最優(yōu)功能化磁性納米粒子的篩選

圖1　不同功能化的磁性納米粒子對Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度的增強和淬滅情況

（圖A、B、C、D、E依次為BG-Fe、BPG-Fe、PAA-Fe、PE-Fe和COOH-MNPs五種磁性粒子對Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度的影響情況，黑色曲線是空白液的ECL強度；紅色曲線是含不同功能化磁性粒子的對比液的ECL強度）

不同功能化的磁性納米粒子對Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度的增強和淬滅情況見圖1。其中BG-Fe、BPG-Fe、PAA-Fe、PE-Fe四種磁性粒子能增強Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度，增強幅度依次為30%、13%、73%、42%；COOH-MNPs磁性粒子可淬滅該體系ECL強度，淬滅幅度為23.2%?？紤]到BG-Fe、BPG-Fe、PE-Fe磁性粒子增強的幅度較PAA-Fe的幅度弱，且前三者磁性納米粒子由于外面具有聚合物聚乙烯亞胺，而聚乙烯亞胺本身就能夠增強ECL強度，因此不能充分說明是否單純是BG-Fe、BPG-Fe、PE-Fe磁性粒子的作用。綜上考慮，本文認(rèn)為PAA-Fe是較理想的、能顯著增強ECL強度的磁性納米粒子，并進(jìn)一步對PAA-Fe磁性納米粒子的使用條件進(jìn)行了優(yōu)化。

3.2磁極方向的影響

圖2　PAA-Fe功能化磁性納米粒子經(jīng)磁鐵正、負(fù)面富集后的發(fā)光情況

（紅色是磁鐵正面、藍(lán)色是磁鐵負(fù)面、黑色是空白）

5μg/mL的PAA-Fe功能化磁性納米粒子經(jīng)磁鐵正、負(fù)面下富集后磁性納米粒子的發(fā)光情況見圖2，由圖看出不同的富集面PAA-Fe功能化磁性納米粒子增強ECL強度的幅度不同，可能是由于正反面與磁鐵的南北極沒有統(tǒng)一下來，而后續(xù)的驗證是在磁鐵負(fù)面富集的情況下進(jìn)行。

3.3富集時間的影響

圖3　PAA-Fe功能化磁性納米粒子不同的富集時間對ECL強度的影響

（紅色：5min；藍(lán)色：20min；綠色：30min；黑色：空白）

5μg/ml的PAA-Fe功能化磁性納米粒子在電極上不同的富集時間對ECL強度的影響見圖3，由圖可看出隨著富集時間的延長，PAA-Fe功能化磁性納米粒子促進(jìn)ECL強度增強的幅度有所減弱，但所有富集時間的試驗組的ECL強度均比空白組的高。

3.4磁微球濃度的影響

圖4　不同PAA-Fe功能化磁性納米粒子濃度對ECL強度的影響

不同PAA-Fe功能化磁性納米粒子濃度對ECL強度的影響見圖4，由圖可看出不同濃度MNPS對ECL強度的影響不大，其中濃度在7μg/mL時ECL強度最強。

4　討論

鑒于新型功能化磁性納米材料為電化學(xué)發(fā)光研究帶來的新機遇，本研究以BG-Fe、BPG-Fe、PAA-Fe、PE-Fe和COOH-MNPs五種不同功能化磁性納米粒子為研究對象，通過電化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)篩選出能夠顯著增強ECL的MNPs，本文研究結(jié)果表明，PAA-Fe是五種新型功能化磁性納米供試材料中最理想的增強ECL的磁性納米粒子，可能是由于PAA-Fe粒徑在幾十納米尺寸范圍內(nèi)，比表面積比較大，增大了發(fā)光試劑的結(jié)合量；加之其表面石墨烯材料既降低了磁性納米粒子的表面活性，抑制了氧化和團聚的現(xiàn)象，同時也增強了電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在磁性材料表面的電子船體，因此進(jìn)一步增強了Ru（bpy）2+3/TPA體系的ECL強度［5-6]。

另外，PAA-Fe功能化磁性納米粒子具有超順磁性，分離方便迅速，背景干擾較小，反應(yīng)都是在液相中進(jìn)行，信號均勻準(zhǔn)確，下一步以PAA-Fe功能化磁性納米粒子作為磁分離的固相載體，結(jié)合電化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)，探討如何在免疫分析、DNA檢測等實際分析應(yīng)用中降低檢測靶標(biāo)的最低檢測限具有更重要的應(yīng)用價值［7]。

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［7]王偉，吳堯，顧忠偉．磁性納米粒子的表面改性及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用［J]．中國材料進(jìn)展，2009，28（1）：43-47．

作者簡介：張艷林（1980—），女，山東聊城人，碩士研究生，實驗師，主要從事環(huán)境監(jiān)測方向教學(xué)和科學(xué)研究。

The Study on Electrochemiluminesence Detection Enhanced byFunctional Magnetic Nanoparticles

ZHANG Yan-lin1，Niu Yusheng2
（1.Guangdong Vocational Co llege of Environm en tal Pro tection Eng ineering，F(xiàn)oshan 528216，China；2.Qingdao Un iversity，Qingdao 266071，Ch ina）

Abst ract：Herein，the effect of f ve different magnetic nanoparticles（MNPs）on electrochemiluminesence（ECL）intensity of the Ru（bpy）2+3/TPA system were conducted.preliminarily operating conditions of the ideal MNPs were optim ized．The result indicated that BG-Fe，BPG-Fe，PAA-Fe and PE-Fe could enhance ECL intensity in the Ru（bpy）2+3/TPA system by method of ECL detection，and the enhanced amplitude of ECL intensity was 30%，13%，73% and 42%，respectively.COOH-MNPs could quench the ECL intensity and the amplitude was 23.2%.The utmost ECL enhancement of Ru（bpy）2+3/TPA system was obtained in the optimum conditions as follows：PAA-Fe concentration of was at 7μg/m l and accumulation for 5 minutes by the magnet.The study is of important signif cance for development of new ECL reagents and establishment of ECL system based on MNPs.

Keywords：Electrochem icaluminescence；Magnetic nanoparticles ；ECL reagents