李春遠，丁唯嘉，王秀芳，羅志剛，谷文祥

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東藥學(xué)院 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006）

天然藥物化學(xué)是運用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和方法研究天然產(chǎn)物中活性成分的學(xué)科［1］，是中藥學(xué)、藥學(xué)、制藥工程、有機化學(xué)、應(yīng)用化學(xué)等藥學(xué)或化學(xué)類相關(guān)專業(yè)本科或碩士研究生的一門專業(yè)課，具有很強的實踐性，其中的天然藥物主要是指陸生中草藥。隨著研究的深入，藥物資源從陸地拓展到海洋，為適應(yīng)這種新的進展，《天然藥物化學(xué)》（第5版，人民衛(wèi)生出版社）教材新增了第十章“海洋天然產(chǎn)物”［2］。天然藥物化學(xué)實驗課程在天然藥物化學(xué)教學(xué)中占有重要的地位，是理論知識和實際操作的紐帶，通過實驗不僅能夠使學(xué)生掌握天然藥物有效成分提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定的基本操作技能，而且能夠更好地培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維以及創(chuàng)新意識與創(chuàng)新能力［3］。然而目前國內(nèi)各高校開設(shè)的天然藥物化學(xué)成分提取分離實驗的研究對象主要包括大黃、槐米、漢防己、麻黃、肉蓯蓉等，幾乎全部為陸生植物，少有報道在天然藥物化學(xué)實驗教學(xué)中開設(shè)有關(guān)微生物或海洋天然產(chǎn)物的實驗內(nèi)容，學(xué)生缺乏對微生物及海洋天然產(chǎn)物研究意義和研究方法的直觀認識，不利于對天然藥物化學(xué)課程相關(guān)內(nèi)容的學(xué)習(xí)。我們提出在天然藥物化學(xué)、天然有機化學(xué)等相關(guān)專業(yè)的實驗課程中，優(yōu)選實驗內(nèi)容開設(shè)海洋微生物天然產(chǎn)物提取分離綜合性實驗，以充分發(fā)揮實驗教學(xué)平臺的作用，促進學(xué)生對天然藥物化學(xué)更加全面深刻的認識。

1 優(yōu)選實驗對象及實驗?zāi)繕水a(chǎn)物

傳統(tǒng)海洋天然產(chǎn)物的研究對象海藻、海綿等無脊椎動物［4］，數(shù)量有限，采集會對生態(tài)平衡造成一定破壞，而以海洋微生物為對象則具有成本低、可人工發(fā)酵、環(huán)境友好等特點［5］。海洋微生物包括海洋真菌、細菌等，其中海洋真菌發(fā)酵耗時長，靜置培養(yǎng)通常需要25d左右，搖床培養(yǎng)也需要14d左右，而細菌發(fā)酵周期則較短，搖床培養(yǎng)僅需3～7d。因此，從學(xué)生實驗的時效性考慮，海洋細菌成為首選。另一方面，作為學(xué)生實驗，不宜以未研究過的新奇菌株為對象。

Bacillus sp.是一類在自然界分布廣泛的革蘭氏陽性菌，其代謝產(chǎn)物絕大多數(shù)為生物堿，種類相對單一，主要包括環(huán)二肽和大環(huán)脂肽類化合物［6－9］。其中環(huán)二肽等小分子生物堿不僅具有廣泛的抗菌、抗腫瘤等生物活性［10］，而且組成單元相對固定，結(jié)構(gòu)鑒定和分離純化等實驗流程易于重復(fù)。因此，在任課教師科研項目研究成果的基礎(chǔ)上，我們選擇一株分離自湛江海岸泥沙的芽孢桿菌Bacillus sp.ms12為對象。該菌主要代謝產(chǎn)物為色氨酸和環(huán)（苯丙－脯）二肽，我們以這2種物質(zhì)為目標產(chǎn)物，優(yōu)化菌株發(fā)酵條件、優(yōu)選提取分離純化方法，設(shè)計了適合于相關(guān)專業(yè)本科生和研究生開設(shè)的綜合性實驗方案。

2 優(yōu)化發(fā)酵條件

為提高學(xué)生實驗的效率，先通過單因素法結(jié)合正交試驗優(yōu)化了菌株Bacillus sp.ms12的發(fā)酵條件。優(yōu)化后的實驗發(fā)酵條件為：蛋白陳7g，酵母粉3g，牛肉膏3g，葡萄糖2g，海鹽25g，水1 000mL，接種量5%，搖床振蕩培養(yǎng)7d。在上述發(fā)酵條件下，每實驗小組僅需發(fā)酵0.6L即可分別成功分離到10mg左右的色氨酸和環(huán)（苯丙－脯）二肽。無論是發(fā)酵量、發(fā)酵時間還是目標產(chǎn)物產(chǎn)率等，都十分適合學(xué)生綜合性實驗開設(shè)的要求。

3 優(yōu)選提取、分離及純化方法

3.1 采用大孔吸附樹脂進行提取

微生物代謝產(chǎn)物提取實驗通常使用有機溶劑如乙酸乙酯、正丁醇等直接對發(fā)酵液萃取的方法［11－12］，該方法消耗溶劑量大［13］、萃取時間長、收率低［14］，在萃取過程中還經(jīng)常由于相分離不完全而產(chǎn)生乳化現(xiàn)象［15］等。相對于傳統(tǒng)的有機溶劑液液提取方法，大孔吸附樹脂由于具有低消耗、高效率、高選擇性、后續(xù)處理簡單并且可再生等優(yōu)勢，在農(nóng)藥、生化藥物的分離純化以及中成藥的制備等方面的應(yīng)用越來越廣泛［16－19］。因此，從學(xué)生實驗高效化、綠色化的角度考慮，我們采用了大孔吸附樹脂法替代有機溶劑提取法。

根據(jù)文獻報道，4g的XAD－16型大孔樹脂可吸附高達1L海洋微生物Chromocleista sp.發(fā)酵液中的環(huán)二肽等小分子含氮化合物［20］，表明該樹脂對小分子生物堿具有優(yōu)秀的吸附能力。我們的預(yù)實驗表明XAD－16樹脂應(yīng)用于菌株Bacillus sp.ms12，對發(fā)酵液中代謝物質(zhì)的靜態(tài)吸附量可達到樹脂體積的7～10倍，并且所吸附的生物堿物質(zhì)較易被無毒的洗脫劑乙醇水溶液解吸出來，用2～3倍樹脂體積的70%乙醇的水溶液即可使其基本解吸完全。該方法既克服了液液萃取過程中溶劑揮發(fā)對環(huán)境的污染，又節(jié)省大量的有機溶劑，并且樹脂再生后可以繼續(xù)使用，既節(jié)能又環(huán)保。

3.2 引入超聲波法進行洗脫分離。

目前對飽和大孔吸附樹脂解吸主要有動態(tài)洗脫和靜態(tài)洗脫2種方式［21］。其中動態(tài)洗脫采用飽和樹脂裝柱，然后用蒸餾水及不同洗脫劑將吸附物洗脫出來。這種洗脫方式由于樹脂置于色譜柱中無法使用超聲等加速解吸，需要消耗相對較多的溶劑和時間以保證洗脫完全。超聲提取技術(shù)利用超聲波的空化作用可加速欲提取成分的溶出，另外超聲波的次級效應(yīng)，如機械振動、乳化、擴散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等，也能加速欲提取成分的擴散釋放并充分與溶劑混合，利于提?。?2］。因此，有必要在解吸過程中使用超聲波輔助以提高效率。

我們設(shè)計采用了動靜態(tài)洗脫相結(jié)合的方式：將飽和樹脂置于三角瓶中，先用蒸餾水浸泡，超聲5min，用布氏漏斗抽濾，濾液保留備用；然后將樹脂重新轉(zhuǎn)移至三角瓶中，依次用50%乙醇水（用來除去非目標產(chǎn)物的干擾雜質(zhì)）、70%乙醇水（洗脫出目標產(chǎn)物）及乙醇（洗脫出柱中的其他成分）洗脫劑重復(fù)上述步驟。與普通動態(tài)洗脫相比，本方法只用1／3的溶劑即可洗脫出相同的提取量，同時還節(jié)省了大量的時間和能源。本步完成后繼續(xù)用蒸餾水對樹脂進行洗滌至無醇味，樹脂即可再次循環(huán)使用。對于收集到不同洗脫溶劑的濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀代替普通蒸餾裝置進行減壓蒸餾，可以在較低的溫度下溫和又快速地對樣品進行濃縮，同時又減少了因試劑揮發(fā)到空氣中而污染環(huán)境，收集到的試劑還可以回收再利用。

3.3 利用制備薄層純化單體化合物

制備薄層層析原理與柱層析相似，都是利用硅膠吸附性能使得不同物質(zhì)在各種極性溶劑條件下解吸能力差異而進行分離純化［23］。在具體實驗操作上，柱層析需要經(jīng)過裝柱、壓柱、上樣、不同溶劑洗脫及洗脫液濃縮檢識合并等步驟，由于樣品從柱底流出且柱體積相對較大，導(dǎo)致解吸過程緩慢，需要消耗大量溶劑，耗時較長。制備薄層層析使用自制或購置的薄層板，由于薄層均勻嚴實，不存在氣泡，其分離效果要優(yōu)于柱層析。同時制備薄層置于展開缸中層析，所需溶劑量大大減少，展開后可根據(jù)紫外或顯色劑檢視刮取目標物色帶，直接用少量大極性溶劑在短柱中洗出即可。因此相對而言，制備薄層層析更加簡便快速且綠色化，更適合學(xué)生實驗少量樣品的分離純化。

點樣是制備薄層層析操作的關(guān)鍵，由于分離的樣品量大，一般不使用圓點點樣而采用條帶點樣。若用常規(guī)的玻璃毛細管或滴管帶狀點樣，容易劃傷薄層，且常出現(xiàn)上樣濃度分布不均勻、上樣帶太寬或不齊等情況，影響分離效果。對此，我們采取的解決措施為在滴管頭處塞上一小段脫脂棉，慢慢將樣品刷到制備薄層板上。制備薄層層析方法對菌株Bacillus sp.ms12的70%乙醇水分段提取物進行純化，效果良好，在1.5h內(nèi)，只用100mL試劑即可獲得15mg色氨酸和8mg環(huán)（苯丙－脯）二肽2種目標產(chǎn)物。

4 用核磁共振氫譜法（HNMR）對實驗產(chǎn)品進行表征

核磁共振是天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定及化學(xué)反應(yīng)機理研究等最常用的工具之一［24－25］，但現(xiàn)有教材提供的天然產(chǎn)物的核磁共振譜圖數(shù)量很少，且多數(shù)比較陳舊，同時由于不是自己分離得到，學(xué)生在學(xué)習(xí)結(jié)構(gòu)解析時普遍缺乏興趣，積極性不高。在此現(xiàn)狀下，我們把HNMR融入到海洋微生物代謝產(chǎn)物分離純化實驗教學(xué)中，引導(dǎo)學(xué)生利用所學(xué)的理論知識解析自己所分離的化合物的結(jié)構(gòu)。

學(xué)生首先對薄層純化所得產(chǎn)品進行薄層檢視，選取薄層層析中斑點單一、純度高的樣品。樣品真空干燥后，裝入核磁管，隨后放入核磁共振儀，依次輸入進樣、鎖場、勻場、采樣等指令得到譜圖。教師引導(dǎo)學(xué)生從峰的種類與質(zhì)子、積分高度與質(zhì)子數(shù)、化學(xué)位移數(shù)值與官能團（基團）關(guān)系等幾處入手，學(xué)生通過認真觀察分析得出結(jié)果。分析圖1，鑒定出化合物1為環(huán)（苯丙－脯）二肽，分析數(shù)據(jù)與文獻［26］基本一致。分析圖2，推測分子是色氨酸，數(shù)據(jù)與色氨酸標準品HNMR數(shù)據(jù)符合。

圖1 實驗分離到的環(huán)（苯丙－脯）二肽的HNMR譜

圖2 實驗分離到的色氨酸的HNMR譜

學(xué)生完成上述結(jié)構(gòu)解析后，教師引導(dǎo)學(xué)生依次思考如下問題：

（1）如何運用HNMR判斷所分離物質(zhì)中有無雜質(zhì)？

（2）自己所分離的化合物的純度情況如何？

（3）雜質(zhì)未被充分除去的原因？

（4）如何進一步增加所分離化合物的純度？

學(xué)生運用學(xué)到的知識結(jié)合教師提示和自己的實驗操作等環(huán)節(jié)解決問題，給出答案。此步驟由學(xué)生在撰寫實驗報告階段完成。學(xué)生為用HNMR譜表征自己分離得到的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)而感到高興，整個過程激發(fā)了學(xué)生的成就感與創(chuàng)新欲望，使學(xué)生較好地掌握了HNMR譜表征與推知天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的方法。

5 結(jié)束語

與陸源生物的次生代謝產(chǎn)物相比，海洋生物由于生活環(huán)境更加復(fù)雜、物種更加多樣，使得其天然產(chǎn)物具有很多新型的骨架和獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在生物活性方面也具有更強烈的作用。近年來，國內(nèi)外天然產(chǎn)物學(xué)家普遍認為從海洋微生物發(fā)掘活性物質(zhì)是利用海洋天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性，同時解決生物資源難再生、保護生態(tài)環(huán)境的最佳選擇。海洋微生物已成為尋找藥物先導(dǎo)化合物的一個新的源泉［27］。與此大背景不相符的是當(dāng)前國內(nèi)高校極少開設(shè)海洋微生物天然產(chǎn)物提取分離實驗，究其原因，主要是因為微生物發(fā)酵周期長、代謝產(chǎn)物成分復(fù)雜，同時提取分離純化過程需消耗大量溶劑，耗資且耗時。針對上述困難，我們依托于自身科研項目，精選一株代謝產(chǎn)物較為簡單的海洋細菌為實驗對象，限定目標產(chǎn)物，以綠色化學(xué)思想為指導(dǎo)設(shè)計實驗方案，通過優(yōu)化菌株發(fā)酵條件、優(yōu)選提取分離純化方法，不僅使實驗學(xué)時、菌株發(fā)酵量、溶劑消耗、環(huán)境污染等降到最低，而且確保高效率地分離純化出目標產(chǎn)物，并指導(dǎo)學(xué)生運用HNMR鑒定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。該實驗有助于學(xué)生全面深刻地認識海洋微生物天然產(chǎn)物的科學(xué)研究流程、增加學(xué)生學(xué)習(xí)興趣、提升學(xué)生操作技能和創(chuàng)新能力。實驗所積累的大量單體化合物還可以進一步加以利用，進行各種生物活性測試或開展結(jié)構(gòu)修飾研究，成為大學(xué)生研究性或設(shè)計性實驗項目的原料，衍生出更多新的創(chuàng)新內(nèi)容。

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