岳 春 李靖靖 方永遠(yuǎn)

YUE Chun 1 LI Jing－jing 2 FANG Yong－yuan 1

（1.南陽理工學(xué)院生化學(xué)院，河南 南陽 473000；2.中州大學(xué)化工食品學(xué)院，河南 鄭州 450044）

（1.School of Biotechnology，Nanyang Institute of Technology，Nanyang，Henan 473004，China；2.Chemistry Engineering and Food Experiment Administrative Center Institute of Zhongzhou University，Zhengzhou，Henan 450000，China）

蟲草多糖為蛹蟲草的重要活性成分，是由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖等組成的多聚糖，具有提高免疫、抗衰老、抗腫瘤、降血脂、抗動脈粥樣硬化、保肝、耐缺氧、鎮(zhèn)靜等作用［1］。目前對蟲草多糖的提取主要采用水熱回流法、超聲波浸提法、超臨界萃取法［2］等，然而水熱回流提取法雖然有利于蟲草多糖的提取，但耗時過長；超聲波提取法具有加速植物中有效成分進(jìn)入溶劑，增加提取率等諸多有利因素，但在試驗中由于多糖提取溫度是主要影響因子，而超聲波所產(chǎn)生溫度僅能達(dá)到50℃左右，這不利于多糖溶解［2］；超臨界萃取法所需的設(shè)備要求比較高而且萃取率較低。所以尋求一種高效、快捷的方法變得迫切需要。

微波輔助萃取技術(shù)是近年來新發(fā)展起來的一種方法，具有穿透性強(qiáng)、選擇性高、加熱效率高等特點，在接近環(huán)境溫度下抽提所需的有效成分，對熱敏性成分的浸提極為有效。微波技術(shù)應(yīng)用于植物細(xì)胞破壁，能有效提高得率，已被廣泛應(yīng)用于各種天然活性成分的提?。?］。

本研究擬將微波輔助提取技術(shù)應(yīng)用于蟲草多糖的提取工藝研究，通過響應(yīng)曲面法設(shè)計試驗［4］，探求微波輔助提取蟲草多糖的最佳工藝條件，在充分利用蛹蟲草資源的基礎(chǔ)上，為蟲草多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供有力的保障。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

蛹蟲草：由南陽理工學(xué)院生化學(xué)院食品實驗室提供；

濃硫酸：東莞市力冠化工有限公司；

95%乙醇：廣州萬從化工有限公司；

無水葡萄糖：北京鵬彩精細(xì)化工有限公司；

丙酮：南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速萬能粉碎機(jī)：FW－200型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK－98－1型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子天平：BS100S型，北京賽多利斯天平有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE－201D型，鞏義市英峪予華儀器廠；

循環(huán)水式真空泵：SHZ－D（Ⅲ）型，鞏義市英峪予華儀器廠；

低速大容量離心機(jī)：TDL－40B型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101－2A型，天津市泰斯特儀器有限公司；

752紫外分光光度計：WF2－2000型，上海龍尼柯儀器有限公司；

微波輔助反應(yīng)儀：XH－MC－1型，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

蛹蟲草→干燥→粉碎→脫脂→浸泡→微波輔助提取→離心→真空濃縮→醇沉→靜置→脫蛋白→沉淀→烘干（50～60℃）→粗多糖→溶解（20～25倍體積的水）→脫色→離心→濃縮→醇沉→沉淀→真空干燥→精制蟲草多糖

1.3.2 操作要點

（1）粉碎：取蛹蟲草烘干粉碎后過80目篩。

（2）脫脂：采用石油醚脫脂，按蟲草粉∶石油醚＝1∶5（m∶V），回流1～2 h。

（3）微波輔助提?。捍_定好所需的功率、時間、料水比后，輻射1 min，間隔1 min后再輻射1 min，如此間隔輻射直至總輻射時間達(dá)到所需要的時間（浸提溫度60～80℃，時間30 min），過濾，然后按同樣條件重復(fù)提取一次。

（4）醇沉：濃縮液冷卻后，加入3倍量95%乙醇使其沉淀，取出上清液，沉淀再用少量水溶解，重復(fù)2次，之后靜置8～24 h。

（5）脫蛋白：采用Sevage法。Sevage試劑：氯仿（三氯甲烷）∶正丁醇＝5∶1；利用蛋白質(zhì)在三氯甲烷等有機(jī)溶劑中變性的特點，將提取液與Sevage試劑5∶1混合，振蕩離心，變性后的蛋白質(zhì)介于提取液與Sevage試劑交界處。棄最下面的氯仿層以及中間的蛋白層，留上層水液（正丁醇密度最小，用量也是最小，飄在水液上面，暫時忽略它），然后再進(jìn)行濃縮和多次醇沉后并用無水乙醇、丙酮和無水乙醚進(jìn)行多次洗滌［5］。

（6）脫色：將活性碳與含蟲草多糖的溶液按固液比1∶5（m∶V）混勻，放置搖床上振搖3 h后取下，過濾除色素。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計 每次精確稱取5.0 g蛹蟲草粉，分別按照不同的微波功率、微波處理時間、料水比、提取次數(shù)進(jìn)行處理，以多糖產(chǎn)率為評價指標(biāo)確定各因素的最佳取值范圍。各單因素試驗的設(shè)計：

（1）微波功率對多糖產(chǎn)率的影響：固定料水比1∶30（m∶V），微波處理時間4 min，提取2次。微波功率分別取300，400，500，600，700 W。

（2）料水比對多糖產(chǎn)率的影響：固定微波功率500 W，處理時間4 min，提取2次。料水比分別取1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40（m∶V）。

（3）微波處理時間對多糖產(chǎn)率的影響：固定微波功率500 W，料水比1∶35（m∶V），提取2次。微波處理時間分別取2，3，4，5，6 min。

（4）提取次數(shù)對多糖產(chǎn)率的影響：固定微波功率500 W，料水比1∶35（m∶V），微波處理時間4 min。分別提取1，2，3次。

1.3.4 響應(yīng)曲面法試驗設(shè)計 本試驗在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗Box－Behnken設(shè)計方案，以微波功率、料水比及微波處理時間為自變量，蟲草多糖得率為響應(yīng)值，對蟲草多糖的微波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.5 蟲草多糖含量的測定 采用硫酸－苯酚法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取0.100 8 g于105℃下干燥至恒重的葡萄糖，置1 000 m L容量瓶中，加適量蒸餾水稀釋至刻度，則質(zhì)量濃度為0.100 8 mg／m L。再分別精密吸取5，10，15，20，25，30 m L于50 m L容量瓶中，定容至刻度，再分別吸取2.0 m L于6個比色管中；各加入6%苯酚溶液1.0 m L，混勻，迅速加入濃硫酸5.0 m L，混勻，沸水浴15 min后，冷卻至室溫，以蒸餾水為空白處理，于490 nm處測定吸光值［5］，并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得方程為y ＝7.957 1x－0.010 3，R2＝0.998 4。

圖1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Figure 1 The standard curve equation of glucose

1.3.6 蟲草多糖產(chǎn)率的測定 蟲草多糖產(chǎn)率按式（1）計算：

式中：

Y—— 蟲草多糖產(chǎn)率，%；

C——吸光值對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的葡萄糖濃度，mg／m L；

V——測定液的體積，m L；

f—— 稀釋倍數(shù)；

W——試驗所取的蛹蟲草粉的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 中心組合試驗設(shè)計方案及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定微波輔助提取的次數(shù)為2，并且得出微波功率、料水比和微波處理時間的因素水平取值范圍見表1。根據(jù)中心組合試驗設(shè)計設(shè)計的方案及試驗結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析試驗因素與水平Table 1 Factors and levels in the response surface design

表2 Box－Behnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Box－Behnken design and results

2.2 模型的建立及顯著性檢驗

利用 Design－Expert（version7.1.6）軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到蟲草多糖產(chǎn)率（Y）對微波功率、水料比、微波處理時間的二次多項回歸模型為

Y ＝11.91＋0.83A＋0.7B＋0.5C＋0.02AB－1.31AC＋0.06BC－1.15A2－0.83B2－0.56C2（2）

由表3可知，模型 P ＝0.000 2＜0.01，表明 Quadratic回歸方差模型是高度顯著的；失擬項P＝0.119 3＞0.05，表明失擬不顯著。模型的調(diào)整確定系數(shù)R2Adj＝0.973 5，說明該模型能夠解釋97.35%的響應(yīng)值變化。因此，該模型擬合程度良好，試驗誤差小，可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測［6］。

2.3 響應(yīng)面圖分析及結(jié)果

2.3.1 微波功率與水料比對蟲草多糖產(chǎn)率影響的響應(yīng)面圖

由圖2可知，當(dāng)微波處理時間固定為4 min時，微波功率和水料比的交互作用對多糖產(chǎn)率影響不顯著（P＝0.875 5）。從微波功率曲面斜率大于水料比曲面的斜率可知，微波功率對于蟲草多糖產(chǎn)率的影響大于水料比對多糖產(chǎn)率的影響。當(dāng)微波功率為500～550 W，料水比為1∶35～1∶38（m∶V）時，多糖的產(chǎn)率較高。

表3 二次回歸模型的響應(yīng)面方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

圖2 微波功率與水料比交互作用的響應(yīng)面圖Figure 2 Response surface of microwave power and water to material ratio

2.3.2 微波功率和微波處理時間對蟲草多糖產(chǎn)率影響的響應(yīng)面圖 由圖3可知，當(dāng)料水比固定為1∶35（m∶V）時，微波功率和處理時間交互作用的等高線呈橢圓形，說明二者交互作用極為顯著。所以一定要控制好微波功率和提取時間，才能有較高的提取率。當(dāng)微波功率為500～550 W，處理時間為3.5～4.5 min時，多糖的產(chǎn)率較高。

圖3 微波功率與微波處理時間交互作用的響應(yīng)面圖Figure 3 Response surface of microwave power and microwave treatment time

2.3.3 水料比和微波處理時間對蟲草多糖得率的影響 由圖4可知，當(dāng)微波功率固定為500 W時，水料比和微波處理時間的交互作用等高線圖趨于圓形，則兩者的交互作用不顯著。當(dāng)微波處理時間很小時，多糖得率普遍較低，這可能是時間短時，細(xì)胞的破壁效果不是很好，導(dǎo)致多糖的溶出率很低，相反，處理時間過長，多糖水解程度加大，導(dǎo)致多糖的得率下降，所以選擇合適的處理時間也是至關(guān)重要的。綜上述，當(dāng)料水比在1∶36～1∶37.5（m∶V），處理時間在4.5 min左右時蟲草多糖有較高的產(chǎn)率。

通過利用 Design Expert（version 7.1.6）軟件以響應(yīng)值（多糖的產(chǎn)率）進(jìn)行優(yōu)化分析，得到蟲草多糖提取的最佳條件為微波功率533.8W，料水比1∶36.73（m∶V），微波處理時間4 min，在此條件下多糖的產(chǎn)率理論值為12.21%。為檢驗響應(yīng)面分析法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件進(jìn)行蟲草多糖的提取，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為微波功率534 W，料水比1∶37（m∶V），處理時間4 min，提取次數(shù)2次。在最佳工藝條件下進(jìn)行5次平行實驗，多糖得率平均值為12.10%，回歸方程所得多糖得率預(yù)測值為12.21%，則兩者之間產(chǎn)生的相對誤差為0.9%，說明回歸方程能較真實地反映各因素對蟲草多糖得率的影響，也有力地說明了響應(yīng)面法在提高蟲草多糖產(chǎn)率方面回歸模型較可靠。

圖4 水料比和微波處理時間交互作用的響應(yīng)面圖Figure 4 Response surface of water to materials ratio and microwave treatment time

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面分析法研究了蟲草多糖的微波輔助提取工藝，建立了蟲草多糖產(chǎn)率的二次回歸方程，經(jīng)驗證該模型極為顯著，可用來預(yù)測響應(yīng)值的變化，通過響應(yīng)面分析得到優(yōu)化后的最佳提取工藝條件為微波功率534 W、提取時間4 min、料水比1∶37（m∶V），提取次數(shù)2次，該條件下多糖提取率為12.10%，與傳統(tǒng)的水熱回流法提取蟲草多糖的得率4.18%［2］來說大大提高了多糖的得率。

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