池 源 王麗波

CHI YuanWANG Li－bo

（東北農(nóng)業(yè)大學理學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

（College of Science，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030，China）

南瓜 （cucurbita moschata Duch），別名番瓜、飯瓜等，是葫蘆科一年生草本植物。南瓜籽為南瓜的成熟種子，含有豐富的不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、植物甾醇、維生素、多糖及礦物質(zhì)等［1，2］。目前市場上已出現(xiàn)的一些南瓜籽提取物保健產(chǎn)品［3］，均含有一定多糖成分，并標注具有降血糖等生物活性。但未見有關(guān)南瓜籽中多糖含量及其生物活性的相關(guān)報道。南瓜籽多糖是否與南瓜果肉多糖一樣具有抗氧化及降血糖的功能［4－6］還有待進一步研究。

目前多糖含量的測定方法常用的主要有蒽酮－硫酸法和苯酚－硫酸法兩種。兩種方法顯色原理基本相同，都是在濃硫酸的作用下將多糖水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，其與蒽酮反應(yīng)可生成藍綠色糠醛衍生物，或與苯酚生成橙黃色化合物，但相比較苯酚－硫酸法具有試驗操作步驟少，穩(wěn)定性好及所用儀器簡單等優(yōu)勢被廣泛用于測定多糖含量［7－9］中。目前，尚未查到有關(guān)使用苯酚－硫酸法測定南瓜籽中多糖含量的報道。因為苯酚－硫酸法本身存在一定波動性，不同的含糖物質(zhì)測定條件均有所不同等特點［10，11］，如果只參考已有文獻的測定條件來確定具體的試驗參數(shù)將可能造成較大的誤差，為提高南瓜籽多糖含量測定結(jié)果的準確性，本研究擬采用苯酚－硫酸法測定南瓜籽中多糖含量，通過優(yōu)化濃硫酸用量、苯酚用量、顯色溫度和顯色時間等試驗條件，并對精密度、加標回收率等進行研究，旨在尋求南瓜籽多糖含量的最佳測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

寶庫1號裸仁南瓜籽：訥河市寶庫良種繁育研究所；

濃硫酸：哈爾濱理工化學試劑有限公司；

苯酚：天津市河東區(qū)紅巖試劑廠；

葡萄糖：天津市風船化學試劑有限公司；

雙光束紫外可見分光光度計：UV－1901型，北京普析通用儀器有限責任公司；

可見分光光度計：WFJ7200型，尤尼科上海儀器有限公司；

電子恒溫不銹鋼水浴鍋：HHS－2S型，上海必爾得實業(yè)有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB－III型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

低速離心機：SC－3610型，安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 南瓜籽粗多糖的制備 取南瓜籽，干燥后用萬能粉碎機粉碎，以無水乙醚為提取劑，采用索氏提取器脫脂，脫完脂后的南瓜籽干粉呈白色。準確稱取7.0 g南瓜籽干粉，加入140 m L的蒸餾水，50℃水浴提取1 h，浸提液5 000 r／min離心20 min，上清液濃縮后加入無水乙醇，至80%的乙醇濃度，靜置過夜，沉淀冷凍干燥，得南瓜籽粗多糖1.1 g。精密稱取一定量南瓜籽粗多糖配制成濃度為0.20 mg／m L的南瓜籽多糖溶液。置于冰箱中冷藏備用。

1.2.2 最大吸收波長的確定 分別吸取南瓜籽多糖溶液和葡萄糖標準溶液各2.0 m L于25 m L具塞試管中，分別加入6%苯酚溶液1.0 m L，搖勻后迅速加入5.0 m L濃硫酸，30℃水浴30 min，以相應(yīng)試劑空白為參比，采用紫外可見分光光度計進行掃描，波長范圍為400～600 nm，確定其最大吸收波長。

1.2.3 濃硫酸用量的確定 吸取2.0 m L南瓜籽多糖溶液于25 m L具塞試管中，加入6%苯酚溶液1.0 m L，搖勻后分別迅速加入濃硫酸4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 m L，搖勻，30℃水浴30 min，測其吸光度值。平行測定3次。

1.2.4 6%苯酚溶液用量的確定 吸取2.0 m L南瓜籽多糖溶液于25 m L具塞試管中，分別加入6%苯酚溶液0.2，0.6，1.0，1.4，1.8 m L，搖勻后迅速加入5.0 m L濃硫酸，搖勻，30℃水浴30 min，測定吸光度值。平行測定3次。

1.2.5 顯色溫度的確定 吸取2.0 m L南瓜籽多糖溶液于25 m L具塞試管中，加入由1.2.4確定的苯酚溶液，搖勻后迅速加入5.0 m L濃硫酸，搖勻分別在0，25，30，50，100℃水浴條件下放置30 min，測定吸光度。平行測定3次。

1.2.6 顯色時間的確定 吸取2.0 m L南瓜籽多糖溶液于25 m L具塞試管中，加入1.0 m L苯酚溶液，搖勻后迅速加入5.0 m L濃硫酸，搖勻于30℃水浴分別處理10，20，30，40，60 min，測定吸光度值。平行測定3次。

1.2.7 標準曲線的繪制 精密稱取干燥的葡萄糖0.025 1 g于250 m L容量瓶中，加水至刻度，配制成0.100 4 mg／m L葡萄糖標準溶液。準確移取葡萄糖標準溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，2.0 m L于25 m L具塞試管中，各以水補至2.0 m L，加入1.0 m L苯酚溶液，搖勻后迅速加入5.0 m L濃硫酸，30℃水浴30 min，測定吸光度?？瞻讓φ找哉麴s水代替糖溶液。

1.2.8 換算因子的計算 精密稱取南瓜籽多糖10.0 mg，加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至50 m L容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，得南瓜籽多糖貯備液。取2.0 m L南瓜籽多糖溶液，按照1.2.7中測定條件測定吸光度，由回歸方程計算出溶液中葡萄糖含量，按文獻［12］的方法檢測換算因子，其計算公式見式（1）。

式中：

f—— 換算因子；

W—— 多糖質(zhì)量，mg；

C——多糖溶液中葡萄糖濃度，mg／m L；

D——多糖的稀釋因子。

1.2.9 精密度試驗 取上述南瓜籽多糖溶液樣品按1.2.7中測定條件平行5次測定，計算相對標準偏差，并分析其重現(xiàn)性。

1.2.10 穩(wěn)定性試驗 按1.2.7中測定條件每隔10 min測定南瓜籽多糖溶液吸光度，1 h后每隔20 min測定一次，考查2 h內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.2.11 加標回收率試驗 分別吸取南瓜籽多糖溶液2.0 m L 3份于25 m L具塞試管中，按方法1.2.7測定吸光度值，由吸光度值平均值計算得南瓜籽多糖含量（以葡萄糖計）。另取3份南瓜籽多糖溶液1.0 m L于25 m L具塞試管中，分別加入1.0 m L葡萄糖標準溶液按方法1.2.7測定吸光度值，計算加標回收率［13］。

1.2.12 南瓜籽多糖含量測定 將市場上購得的裸仁南瓜籽按方法1.2.1制備南瓜籽多糖，再按方法1.2.7測定其吸光度值，根據(jù)標準曲線方程和換算因子計算出南瓜籽多糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

最大吸收波長掃描結(jié)果見圖1。由圖1可知，葡萄糖標準溶液和南瓜籽多糖溶液均在486 nm處有最大吸收，說明以葡萄糖為標品測定南瓜籽多糖含量的方法可靠。因此以下試驗均選取486 nm為測定波長。

2.2 濃硫酸用量的確定

圖1 最佳測定波長的選擇Figure 1 Scanning spectra

濃硫酸用量對溶液吸光度的影響見圖2。由圖2可知，隨著濃硫酸加入量的增加，溶液的吸光度先升高后下降，當濃硫酸加入量為5.0 m L時，吸光度達到最高值0.554，相對標準偏差RSD＝0.26%（n＝3）。 加入量超過5.0 m L后，吸光度大幅度下降，可能是由于濃硫酸過多會使多糖碳化嚴重。由此，在以下的試驗中使用5.0 m L濃硫酸。

圖2 不同硫酸用量的吸光度比較Figure 2 Effects of different sulfuric acid amounts on color results

2.3 6%苯酚溶液用量的確定

苯酚用量對溶液吸光度的影響見圖3。由圖3可知，隨著苯酚溶液用量的增加，多糖溶液的吸光值也相應(yīng)增加，并在1.0 m L時出現(xiàn)最大值0.500，相對標準偏差 RSD＝0.60%（n＝3），之后隨著苯酚溶液用量繼續(xù)增加吸光度下降，所以選取1.0 m L為最佳苯酚溶液用量。

圖3 不同苯酚用量的吸光度比較Figure 3 Effects of different phenol amounts on color results

2.4 顯色溫度的確定

顯色溫度對溶液吸光度的影響見圖4。由圖4可知，吸光度隨著顯色溫度提高同樣呈現(xiàn)先升后降的趨勢。在30℃時，吸光度值最高，為0.547，相對標準偏差 RSD＝0.62%（n＝3）。試驗中還發(fā)現(xiàn)，由于試管內(nèi)濃硫酸與多糖反應(yīng)劇烈放熱，迅速放進冰水浴條件下顯色，極易造成具塞試管底部破裂。所以，30℃水浴為本試驗的最佳顯色溫度。

2.5 顯色時間的確定

顯色時間對溶液吸光度的影響見圖5。由圖5可知，在30 min內(nèi)，隨著顯色時間的增加，吸光度逐漸升高，30 min時吸光度值為0.537，相對標準偏差RSD＝0.32% （n＝3），之后南瓜籽多糖溶液的吸光度趨于平穩(wěn)，可能是水浴30 min時溶液恰好顯色完全。所以，本試驗中水浴30 min為最佳顯色時間。

圖4 不同顯色溫度的吸光度比較Figure 4 Effects of different temperatures on color results

圖5 不同顯色時間的吸光度比較Figure 5 Effects of different developing time

2.6 標準曲線的繪制

以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線見圖6。由圖6可知，葡萄糖濃度在0～100μg／m L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。其回歸方程為y ＝0.012 3x－0.001 6，相關(guān)系數(shù)r為0.998 2。

2.7 換算因子的計算

圖6 葡萄糖標準曲線Figure 6 Glucose standard curve on color results

按1.2.7方法測定南瓜籽多糖溶液的吸光度值為0.455，經(jīng)標準曲線回歸方程計算得葡萄糖質(zhì)量濃度為0.018 6 mg／m L，按照1.2.8中換算因子計算公式，計算得換算因子f＝10.75。

2.8 精密度試驗

同一多糖溶液，相同條件重復(fù)測定吸光度5次，計算所得吸光度平均值0.507，標準偏差0.004 69，相對平均偏差RSD＝0.93% （n＝5），表明重現(xiàn)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗

由表1可知，南瓜籽多糖溶液在120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好，隨著時間的增加，吸光度值略有下降，尤其在前60 min內(nèi)吸光度值由最初0.504只降至0.501，120 min時降至0.496。相對平均偏差RSD＝0.66%。

2.10 加標回收率試驗

經(jīng)計算南瓜籽多糖含量為20.66μg／m L（以葡萄糖計）。由表2可知，經(jīng)測定該方法的平均加標回收率100.75%，相對平均偏差RSD＝0.83%（n＝3），說明該測定方法準確可信。

表1 穩(wěn)定性測定結(jié)果Table 1 Results of stability experiments

表2 加標回收率試驗結(jié)果Table 2 The addition recovery result

2.11 南瓜籽多糖含量測定

按方法1.2.7測定南瓜籽多糖溶液吸光度值為0.439，從而計算出南瓜籽粗多糖中總糖含量為17.9%。

3 結(jié)論

使用苯酚－硫酸法測定南瓜籽多糖含量，濃硫酸用量、苯酚溶液用量、顯色時間、顯色溫度等因素對南瓜籽多糖溶液的吸光度均有不同程度的影響，通過優(yōu)化上述試驗條件，得出較優(yōu)條件為波長486 nm，6%苯酚溶液1.0 m L，濃硫酸5.0 m L，在30℃水浴30 min的條件下顯色，平均加標回收率為100.75%，RSD為0.83%，測得樣品中多糖的含量為17.9%。該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，簡便快速，適用于南瓜籽中多糖含量的定量測定。

本試驗結(jié)果也證實在南瓜籽中的確含有一定量的多糖成分，以此為基礎(chǔ)，筆者正在進一步展開對南瓜籽中多糖的生物活性及其功能的研究，研究成果將有望彌補國內(nèi)外在該領(lǐng)域的研究空白。

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