周興旺 張繼紅 鄒 橋 張 麗

ZHOU Xing－wang ZH ANG Ji－h(huán)ong ZOU QiaoZH ANG Li

（湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410117）

（Hunan Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research，Changsha，Hunan 410117，China）

氯霉素具有廣譜抗菌能力，曾被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)，但氯霉素用于食用性動(dòng)物會(huì)通過食物鏈傳遞給人類，人體長期食用含氯霉素的食物，會(huì)造成腸道正常菌群失調(diào)，并抑制骨髓造血功能［1－3］。中國農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告《動(dòng)物源性食品中獸藥最高殘留限量》中明確規(guī)定氯霉素禁止使用，在動(dòng)物性食品中不得檢出。歐盟、美國的法規(guī)均明確規(guī)定在食品中“不得檢出”氯霉素。因此，準(zhǔn)確測(cè)定奶粉中的氯霉素十分重要。目前，中國關(guān)于奶粉中氯霉素含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道較少，任佳等［4，5］介紹的檢測(cè)奶粉中氯霉素的檢測(cè)方法，其前處理步驟長，且較復(fù)雜。中國也沒有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)，中國各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)奶粉中氯霉素的方法也沒有統(tǒng)一，關(guān)于不同樣品前處理方法及定量方法對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響也未見報(bào)道。因此，比較分析不同前處理方法和定量方法對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響對(duì)于準(zhǔn)確測(cè)定奶粉中的氯霉素含量具有十分重要的意義。本研究擬參考中國常用的國家標(biāo)準(zhǔn)［6，7］，探討不同樣品前處理方法及定量方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果精度的影響，旨在為廣大分析工作者和標(biāo)準(zhǔn)制修訂工作者提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

奶粉：為抽查購買的樣品（用方法A確定是陰性或陽性樣品），留作科研樣品用；

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度98.5%，德國 Dr.Ehrenstorfer公司；

D5－氯霉 素 內(nèi) 標(biāo) 物：100ug／m L，德 國 Dr.Ehrenstorfer公司；

乙腈：色譜純，美國Tedia公司；

乙酸乙酯、正己烷、乙酸銨：國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

液相色譜－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：Thermo TSQ Ultra AM型，美國 Thermo Fisher公司；

色譜柱：Hypersil Gold型，美國 Thermo Fisher公司；

高速振蕩器：CUTE MIXER CM－1000型，日本 Tokyo Rikakakai公司；

離心機(jī)：TG16－WS型，湖南湘儀儀器開發(fā)公司；

漩渦混勻器：VORTEX－2型，美國 Scientific Industries公司；

氮吹儀：TTL－DCⅡ型，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；

電子天平：Sartouris BS224S型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同前處理方法

（1）前處理方法 A：參考 GB／T 22338－2008 中的5.3.1.1，稱 取 2 g 試 樣 至 50 m L 塑 料 離 心 管 中，加 入0.2 m L D5－氯霉素內(nèi)標(biāo)溶液（10 ng／m L）、10 m L 飽和氯化鈉、10 m L乙腈，漩渦混勻后高速震蕩提取5 min，以6 000 r／min離心10 min，上清液收集于玻璃管中，殘?jiān)偌尤? m L乙腈重復(fù)提取1次，合并上清液于玻璃管中，60℃氮吹至約2 m L，加入乙腈飽和的正己烷除去脂肪，乙腈溶液繼續(xù)吹干，殘留物用1.0 m L乙腈水混合溶劑（20∶80）溶解，用0.22μm有機(jī)濾膜過濾后上機(jī)測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。

（2）前處理方法 B：參考 GB／T 22338－2008 中的5.3.1.1，與處理方法 A 基本一致，只是沒有加入飽和氯化鈉。

（3）前處理方法 C：參考 GB／T 22338－2008 中的5.3.1.3，稱取2.00 g試樣至50 m L塑料離心管中，加入2 m L水溶解樣品，并加入0.2 m L D5－氯霉素內(nèi)標(biāo)溶液（10 ng／m L）、10 m L 乙 酸 乙 酯，高 速 漩 渦 萃取 5 min，以6 000 r／min離心10 min，上清液收集于玻璃管中，殘?jiān)偌尤? m L乙酸乙酯提取1次，合并提取液，乙酸乙酯提取液在60℃減壓旋轉(zhuǎn)濃縮至干，殘留物用2.0 m L乙腈溶解，加入乙腈飽和的正己烷除去脂肪，乙腈溶液繼續(xù)吹干，殘留物用1.0 m L乙腈水混合溶劑（20∶80）溶解，用0.22μm有機(jī)濾膜過濾后上機(jī)測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。

（4）前 處 理 方 法 D：參 考 SN／T 1864－2007 中 的2.4.2.a，基本與C處理方法一致，只是沒有加入2 m L水。1.2.2 定容溶劑的選擇 分別用純水、純乙腈和乙腈＋水混合溶劑（體積比＝20／80）配制氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)使用液，并上機(jī)分析。

1.2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 稱取2.00 g陰性奶粉樣品，加入2 ng／m L的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 m L，然后按照 A、B、C、D 4種方法進(jìn)行前處理，并用內(nèi)標(biāo)法定量。

1.2.4 不同定量方法的比較研究 將方法A處理的陽性樣品溶液，上機(jī)測(cè)定，分別用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

1.3 測(cè)定條件

1.3.1 色譜參考條件 色譜柱：Hypersil Gold，150 mm×4.6 mm，3μm；流動(dòng)相：5 m M 乙酸銨水溶液、水和乙腈，梯度條件見表1；流速：0.200 m L／min；進(jìn)樣量：5μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Binary mobile phase composition program

1.3.2 質(zhì)譜分析條件 采用電噴霧離子化源（ESI），通過負(fù)離子多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）對(duì)氯霉素及其內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。噴霧電壓：2 500 V；蒸發(fā)溫度：300 ℃；鞘氣壓力：300 k Pa；掃氣壓力：0 Pa；輔助氣流量：5 L／min；毛細(xì)管溫度：350℃。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞氣能量及去簇電壓見表2。

表2 氯霉素及內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectral parameters of chloramphenicol and internal standard

2 結(jié)果與討論

2.1 定容溶劑的選擇

氯霉素在乙腈的溶解性優(yōu)于在純水中的，但流動(dòng)相的初始條件中乙腈的含量約為20%，用純乙腈溶解的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其總離子流色譜圖峰形不好，而用乙腈＋水的混合溶劑（20∶80）配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其峰形較好（見圖1），這是由于色譜分析中的溶劑效應(yīng)。另外，添加了少量乙腈的樣品定容液可以抑制微生物的生長，便于保存。因此，綜合考慮溶解性、峰形和保存的狀況，選擇乙腈和水的混合溶劑（20∶80）作為溶劑較好。

2.2 不同前處理方法對(duì)同一陽性樣品測(cè)定結(jié)果的影響

分別采用4種不同的處理方法對(duì)同一陽性樣品中的氯霉素進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表3。

由表3可知，方法A、C測(cè)定結(jié)果基本一致，而方法B和D均未檢出，說明不同前處理方法帶來的最終結(jié)果可能會(huì)顯著不同。

2.3 4種處理方法的加標(biāo)回收率

為考察方法B、D測(cè)定結(jié)果是否由處理過程中的損失帶來的，本研究做了4種方法的加標(biāo)回收率試驗(yàn)。表4為采用不同處理方法的加標(biāo)回收情況。

圖1 氯霉素及D5－氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品總離子流色譜圖 （tr＝4.38 min）Figure 1 Total ion chromatogram of chloramphenicol and D5－chloramphenicol

表3 4種處理方法對(duì)同一陽性樣品的測(cè)定結(jié)果Table 3 Testing result of four pretreatment method for the same positive sample（n ＝3）

表3 4種處理方法對(duì)同一陽性樣品的測(cè)定結(jié)果Table 3 Testing result of four pretreatment method for the same positive sample（n ＝3）

未檢出：＜0.1μg／kg。

方法測(cè)定值／（μg·kg－1）1 2 3平均值／（μg·kg－1） RSD／%A 1.48 1.44 1.52 1.48 1.9 B 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 ／C 1.31 1.42 1.47 1.40 5.6 D 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 ／

表4 4種不同前處理方法的加標(biāo)回收率比較Table 4 Mean recoveries for chloramphenicol in milk powder at the level of 1.0μg／kg（n ＝3）

由表4可知，4種處理方法回收率并無顯著差異。這說明表3的測(cè)定結(jié)果的差異并不是由樣品處理過程中目標(biāo)物的損失引起的，而是由提取效果的差異而產(chǎn)生的。這也表明良好的加標(biāo)回收率并不代表此方法能準(zhǔn)確測(cè)定樣品中的某一組分。B、D法未能檢出氯霉素的結(jié)果說明，氯霉素在乙腈和乙酸乙酯中的溶解性雖然很好，但可能由于奶粉不溶于乙腈和乙酸乙酯，導(dǎo)致溶劑無法與目標(biāo)物接觸，從而無法提取奶粉中的氯霉素。

2.4 兩種定量方法測(cè)定結(jié)果的比較分析

將方法A處理的陽性樣品分別用兩種定量方法測(cè)定，結(jié)果及精密度見表5。

表5 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較Table 5 Comparison of determination results of chloramphenicol between internal standard and external standard methods

由表5可知，內(nèi)標(biāo)法的精密度優(yōu)于外標(biāo)法，其測(cè)定結(jié)果高于外標(biāo)法，原因有二：① 樣品前處理造成目標(biāo)物一定程度的損失，同位素內(nèi)標(biāo)法的校正因子可以校正這種損失，外標(biāo)法無法校正這種損失；② 由于質(zhì)譜定量分析的基質(zhì)效應(yīng)，相同濃度的樣品基質(zhì)目標(biāo)物信號(hào)值低于純標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物的信號(hào)值。而同位素內(nèi)標(biāo)法能很好地解決上述兩個(gè)問題，因此，選擇內(nèi)標(biāo)法定量測(cè)定奶粉中的氯霉素，其結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，加標(biāo)回收率僅能體現(xiàn)試驗(yàn)過程的目標(biāo)物損失情況，而并不能體現(xiàn)對(duì)樣品中目標(biāo)物的提取程度，但可為廣大分析工作者提供一種快速測(cè)定奶粉中氯霉素含量的檢測(cè)方法。該法用飽和氯化鈉水溶解奶粉，并用乙腈漩渦震蕩提取，內(nèi)標(biāo)法定量，可快速準(zhǔn)確地測(cè)定奶粉中的氯霉素含量。

1 王花茹，王加才.骨髓造血機(jī)能的潛在殺手氯霉素殘留危害及檢測(cè)［J］.中國動(dòng)物保健，2008（10）：43～44.

2 吳曉豐，楊露花.氯霉素殘留的危害及檢測(cè)方法［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004，25（3）：41～43.

3 李海平，張樹海，張坤生.GC－MS法分析法在豬肉氯霉素殘留檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.食品與機(jī)械，2006，22（5）：89～92.

4 任佳，鄭小平，黃菲菲，等.UPLC－MS／MS法測(cè)定乳制品中的氯霉素類藥物［J］.食品與機(jī)械，2011，27（4）：75～77.

5 李丹妮，嚴(yán)鳳，張文剛，等.超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法對(duì)奶粉中氯霉素殘留量的檢測(cè)［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008（27）：161～163.

6 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB／T 22338－2008動(dòng)物源食品中氯霉素類藥物殘留量的測(cè)定［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

7 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.SN／T 1864－2007進(jìn)出口動(dòng)物源食品中氯霉素殘留量的檢測(cè)方法 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.